Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy użycie zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłość wsparcia, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Toxoplasma gondii jest wewnątrzkomórkowym pierwotniakiem, który moduluje mikrośrodowisko zakażonego żywiciela i jest powiązany z występowaniem nowotworu mózgu.W tym badaniu stawiamy hipotezę, że egzosomalny miRNA-21 z zakażenia Toxoplasma sprzyja wzrostowi guza mózgu.Scharakteryzowano egzosomy mikrogleju BV2 zakażonego Toxoplasma i potwierdzono internalizację komórek glejaka U87.Profile ekspresji egzosomalnego mikroRNA analizowano przy użyciu macierzy mikroRNA i mikroRNA-21A-5p związanych z Toxoplasma gondii i sortowaniem guza.Zbadaliśmy także poziomy mRNA genów związanych z nowotworem w komórkach glejaka U87, zmieniając poziomy miR-21 w egzosomach i wpływ egzosomów na proliferację ludzkich komórek glejaka U87.W egzosomach komórek glejaka U87 zakażonych Toxoplasma gondii ekspresja mikroRNA-21 jest zwiększona, a aktywność genów przeciwnowotworowych (FoxO1, PTEN i PDCD4) jest zmniejszona.Egzosomy pochodzące z BV2 zakażone Toxoplasma indukują proliferację komórek glejaka U87.Egzosomy indukują wzrost komórek U87 w mysim modelu nowotworu.Sugerujemy, że zwiększony egzosomalny miR-21 w mikrogleju BV2 zakażonym Toxoplasma może odgrywać ważną rolę jako promotor wzrostu komórek w komórkach glejaka U87 poprzez regulację w dół genów przeciwnowotworowych.
Szacuje się, że w 2018 r. na całym świecie zdiagnozowano ponad 18,1 mln przypadków zaawansowanych nowotworów, a każdego roku diagnozuje się około 297 000 nowotworów ośrodkowego układu nerwowego (1,6% wszystkich nowotworów)1.Poprzednie badania wykazały, że czynnikami ryzyka rozwoju nowotworów mózgu u ludzi są różne produkty chemiczne, wywiad rodzinny oraz promieniowanie jonizujące pochodzące ze sprzętu terapeutycznego i diagnostycznego głowy.Jednak dokładna przyczyna tych nowotworów nie jest znana.Około 20% wszystkich nowotworów na świecie jest powodowanych przez czynniki zakaźne, w tym wirusy, bakterie i pasożyty3,4.Zakaźne patogeny zakłócają mechanizmy genetyczne komórki gospodarza, takie jak naprawa DNA i cykl komórkowy, i mogą prowadzić do przewlekłego stanu zapalnego i uszkodzenia układu odpornościowego5.
Czynniki zakaźne związane z nowotworami u ludzi to najczęstsze patogeny wirusowe, w tym wirusy brodawczaka ludzkiego oraz wirusy zapalenia wątroby typu B i C.Pasożyty mogą również odgrywać potencjalną rolę w rozwoju raka u ludzi.Kilka gatunków pasożytów, mianowicie Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis i Hymenolepis nana, powiązano z różnymi typami nowotworów u ludzi 6,7,8.
Toxoplasma gondii jest wewnątrzkomórkowym pierwotniakiem regulującym mikrośrodowisko zakażonych komórek gospodarza.Szacuje się, że pasożyt ten zakaża około 30% światowej populacji, narażając całą populację na ryzyko9,10.Toxoplasma gondii może infekować ważne narządy, w tym centralny układ nerwowy (OUN), i powodować poważne choroby, takie jak śmiertelne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i zapalenie mózgu, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością9.Jednakże Toxoplasma gondii może również zmieniać środowisko zakażonego żywiciela poprzez modulowanie wzrostu komórek i odpowiedzi immunologicznej u osób z prawidłową odpornością, co prowadzi do utrzymywania się bezobjawowego przewlekłego zakażenia9,11.Co ciekawe, biorąc pod uwagę korelację między częstością występowania T. gondii a częstością występowania guza mózgu, niektóre doniesienia sugerują, że zmiany środowiskowe żywiciela in vivo spowodowane przewlekłą infekcją T. gondii przypominają mikrośrodowisko guza.
Egzosomy są znane jako komunikatory międzykomórkowe, które dostarczają zawartość biologiczną, w tym białka i kwasy nukleinowe, z sąsiadujących komórek16,17.Egzosomy mogą wpływać na procesy biologiczne związane z nowotworem, takie jak antyapoptoza, angiogeneza i przerzuty w mikrośrodowisku guza.W szczególności miRNA (miRNA), małe niekodujące RNA o długości około 22 nukleotydów, są ważnymi regulatorami genów potranskrypcyjnych, które kontrolują ponad 30% ludzkiego mRNA poprzez kompleks wyciszający indukowany miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii może zakłócać procesy biologiczne poprzez kontrolowanie ekspresji miRNA u zakażonych gospodarzy.MiRNA gospodarza zawierają ważne sygnały regulujące procesy biologiczne gospodarza w celu osiągnięcia strategii przetrwania pasożyta.Zatem badanie zmian w profilu miRNA gospodarza po zakażeniu T. gondii może pomóc nam lepiej zrozumieć interakcję między gospodarzem a T. gondii.Rzeczywiście, Thirugnanam i in.15 zasugerowali, że T. gondii sprzyja karcynogenezie mózgu poprzez zmianę jego ekspresji na specyficznych miRNA gospodarza związanych ze wzrostem nowotworu i odkryli, że T. gondii może powodować glejaki u zwierząt doświadczalnych.
Badanie to koncentruje się na zmianie egzosomalnego miR-21 w mikrogleju gospodarza zakażonym Toxoplasma BV2.Zaobserwowaliśmy możliwą rolę zmienionego egzosomalnego miR-21 we wzroście komórek glejaka U87 z powodu zatrzymania w jądrze FoxO1/p27, który jest celem nadeksprymowanego miR-21.
Egzosomy pochodzące z BV2 uzyskano za pomocą wirowania różnicowego i zwalidowano różnymi metodami, aby zapobiec zanieczyszczeniu składnikami komórkowymi lub innymi pęcherzykami.Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE) wykazała wyraźne wzorce między białkami ekstrahowanymi z komórek BV2 i egzosomów (Figura 1A), a próbki oceniano pod kątem obecności Alix, co analizowano metodą Western blot markerów białek egzosomalnych w .Znakowanie Alix stwierdzono w białkach egzosomów, ale nie w białkach lizatu komórek BV2 (ryc. 1B).Dodatkowo analizowano oczyszczony RNA z egzosomów pochodzących z BV2 za pomocą bioanalizatora.Podjednostki rybosomów 18S i 28S rzadko obserwowano we wzorze migracji egzosomalnego RNA, co wskazuje na wiarygodną czystość (Figura 1C).Wreszcie transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała, że ​​obserwowane egzosomy miały rozmiar około 60–150 nm i strukturę przypominającą miseczkę, typową dla morfologii egzosomów (ryc. 1D).
Charakterystyka egzosomów pochodzących z komórek BV2.(A) Strona karty charakterystyki.Białka izolowano z komórek BV2 lub egzosomów pochodzących z BV2.Wzory białek różnią się między komórkami i egzosomami.(B) Analiza Western blot markera egzosomalnego (Alix).(C) Ocena oczyszczonego RNA z komórek BV2 i egzosomów pochodzących z BV2 przy użyciu bioanalizatora.Zatem podjednostki rybosomalne 18S i 28S w komórkach BV2 rzadko znajdowano w egzosomalnym RNA.(D) Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała, że ​​egzosomy wyizolowane z komórek BV2 zostały ujemnie wybarwione 2% octanem uranylu.Egzosomy mają wielkość około 60–150 nm i kształt miseczki (Song i Jung, dane niepublikowane).
Internalizację komórkową egzosomów pochodzących z BV2 do ludzkich komórek glejaka U87 obserwowano za pomocą mikroskopii konfokalnej.Egzosomy znakowane PKH26 są zlokalizowane w cytoplazmie komórek U87.Jądra barwiono DAPI (ryc. 2A), co wskazuje, że egzosomy pochodzące z BV2 mogą być internalizowane przez komórki gospodarza i wpływać na środowisko komórek biorców.
Internalizacja egzosomów pochodzących z BV2 do komórek glejaka U87 i egzosomów pochodzących z BV2 zakażonych Toxoplasma RH indukowała proliferację komórek glejaka U87.(A) Egzosomy pochłonięte przez komórki U87 mierzone za pomocą mikroskopii konfokalnej.Komórki glejaka U87 inkubowano z egzosomami znakowanymi PKH26 (czerwony) lub bez kontroli przez 24 godziny.Jądra barwiono DAPI (niebieski), a następnie obserwowano pod mikroskopem konfokalnym (pasek skali: 10 μm, x 3000).(B) Proliferację komórek glejaka U87 określono za pomocą testu proliferacji komórek.Komórki glejaka U87 traktowano egzosomami przez wskazany czas. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 w teście t-Studenta. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta.
Po potwierdzeniu internalizacji egzosomów pochodzących z BV2 do komórek glejaka U87, przeprowadziliśmy testy proliferacji komórek w celu zbadania roli egzosomów pochodzących z BV2 pochodzących z Toxoplasma w rozwoju ludzkich komórek glejaka.Traktowanie komórek U87 egzosomami komórek BV2 zakażonych T. gondii wykazało, że egzosomy pochodzące z BV2 zakażonych T. gondii powodowały znacząco wyższą proliferację komórek U87 w porównaniu z kontrolą (ryc. 2B).
Ponadto wzrost komórek U118 dał takie same wyniki jak U87, ponieważ egzosomy stymulowane Toxoplasma powodowały najwyższy poziom proliferacji (dane nie pokazane).Na podstawie tych danych możemy wskazać, że egzosomy zakażone Toxoplazmą pochodzącą od wirusa BV2 odgrywają ważną rolę w proliferacji komórek glejaka.
Aby zbadać wpływ egzosomów pochodzących z BV2 zakażonych Toxoplasma na rozwój nowotworu, wstrzyknęliśmy komórki glejaka U87 nagim myszom w celu uzyskania modelu heteroprzeszczepu i wstrzyknęliśmy egzosomy pochodzące z BV2 lub egzosomy pochodzące z BV2 zakażone RH.Gdy guzy stały się widoczne po 1 tygodniu, każdą grupę doświadczalną składającą się z 5 myszy podzielono według wielkości guza w celu określenia tego samego punktu początkowego i wielkość guza mierzono przez 22 dni.
U myszy z modelem ksenoprzeszczepu U87 zaobserwowano znacznie większy rozmiar i masę guza w grupie egzosomów zakażonych RH pochodzącym od BV2 w dniu 22 (ryc. 3A, B).Z drugiej strony nie było znaczącej różnicy w wielkości guza pomiędzy grupą egzosomów pochodzących z BV2 a grupą kontrolną po leczeniu egzosomami.Ponadto myszy, którym wstrzyknięto komórki glejaka i egzosomy, wizualnie wykazywały największą objętość guza w grupie egzosomów pochodzących z BV2 zakażonych RH (ryc. 3C).Wyniki te pokazują, że egzosomy zakażone Toxoplazmą pochodzącą z BV2 indukują wzrost glejaka w mysim modelu nowotworu.
Onkogeneza (AC) egzosomów pochodzących z BV2 w mysim modelu heteroprzeszczepu U87.Rozmiar guza (A) i masa (B) były znacząco zwiększone u nagich myszy BALB/c leczonych egzosomami zakażonymi RH pochodzącymi z BV2.Nagim myszom BALB/c (C) wstrzyknięto podskórnie 1 x 107 komórek U87 zawieszonych w mieszaninie Matrigel.Sześć dni po wstrzyknięciu myszom podano 100 µg egzosomów pochodzących z wirusa BV2.Rozmiar i masę guza mierzono odpowiednio we wskazanych dniach i po uśmierceniu. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Dane wykazały, że 37 miRNA (16 z nadekspresją i 21 z obniżoną ekspresją) związanych z odpornością lub rozwojem nowotworu uległo istotnym zmianom w mikrogleju po zakażeniu szczepem Toxoplasma RH (ryc. 4A).Względne poziomy ekspresji miR-21 wśród zmienionych miRNA potwierdzono metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym w egzosomach pochodzących z BV2, egzosomach traktowanych komórkami BV2 i U87.Ekspresja miR-21 wykazała znaczny wzrost egzosomów z komórek BV2 zakażonych Toxoplasma gondii (szczep RH) (ryc. 4B).Względny poziom ekspresji miR-21 w komórkach BV2 i U87 wzrósł po pobraniu zmienionych egzosomów (ryc. 4B).Względne poziomy ekspresji miR-21 w tkankach mózgu pacjentów z nowotworem i myszy zakażonych Toxoplasma gondii (szczep ME49) były odpowiednio wyższe niż w grupie kontrolnej (ryc. 4C).Wyniki te korelują z różnicami pomiędzy poziomami ekspresji przewidywanych i potwierdzonych mikroRNA in vitro i in vivo.
Zmiany w ekspresji egzosomalnego miP-21a-5p w mikrogleju zakażonym Toxoplasma gondii (RH).(A) Wykazuje znaczące zmiany w siRNA związane z odpornością lub rozwojem nowotworu po zakażeniu T. gondii RH.(B) Względne poziomy ekspresji miR-21 wykryto za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym w egzosomach pochodzących z BV2, egzosomach traktowanych BV2 i komórkach U87.(C) Względne poziomy ekspresji miR-21 stwierdzono w tkankach mózgu pacjentów z nowotworem (N=3) i myszy zakażonych Toxoplasma gondii (szczep ME49) (N=3). *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta.
Egzosomy z komórek BV2 zakażonych RH prowadziły do ​​wzrostu glejaków in vivo i in vitro (ryc. 2, 3).Aby wykryć odpowiednie mRNA, zbadaliśmy poziomy mRNA docelowych genów przeciwnowotworowych, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN i programowanej śmierci komórki 4 (PDCD4) w komórkach U87 zakażonych egzosomami pochodzącymi z BV2 lub RH BV2.Analiza bioinformatyczna wykazała, że ​​kilka genów związanych z nowotworem, w tym geny FoxO1, PTEN i PDCD4, ma miejsca wiązania miR-2121,22.Poziomy mRNA docelowych genów przeciwnowotworowych były zmniejszone w egzosomach pochodzących z BV2 zakażonych RH w porównaniu z egzosomami pochodzącymi z BV2 (ryc. 5A).FoxO1 wykazał obniżony poziom białka w egzosomach pochodzących z BV2 zakażonych RH w porównaniu z egzosomami pochodzącymi z BV2 (Figura 5B).Na podstawie tych wyników mogliśmy potwierdzić, że egzosomy pochodzące z BV2 zakażonego RH regulują w dół geny antyonkogenne, utrzymując ich rolę we wzroście nowotworu.
Egzosomy pochodzące z BV2 zakażone Toxoplasma RH indukują supresję genów przeciwnowotworowych w komórkach glejaka U87 przez egzosomy pochodzące z BV2 zakażone Toxoplasma RH.(A) PCR w czasie rzeczywistym ekspresji FoxO1, PTEN i PDCD4 w egzosomach pochodzących z BV2 zakażonego T. gondii RH w porównaniu z egzosomami PBS.Jako kontrolę zastosowano mRNA β-aktyny.(B) Ekspresję FoxO1 określono metodą Western blot, a dane densytometryczne oceniano statystycznie przy użyciu programu ImageJ. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta.
Aby zrozumieć wpływ miP-21 w egzosomach na regulację genów związaną z nowotworem, komórki U87 transfekowano inhibitorem miP-21 przy użyciu Lipofectamine 2000 i komórki zebrano 24 godziny po transfekcji.Poziomy ekspresji FoxO1 i p27 w komórkach transfekowanych inhibitorami miR-21 porównano z komórkami traktowanymi egzosomami pochodzącymi z BV2 za pomocą qRT-PCR (ryc. 6A, B).Transfekcja inhibitora miR-21 do komórek U87 znacząco obniżyła ekspresję FoxO1 i p27 (RYS. 6).
Zakażona RH egzosomalna miP-21 pochodząca z BV2 zmieniła ekspresję FoxO1/p27 w komórkach glejaka U87.Komórki U87 transfekowano inhibitorem miP-21 przy użyciu Lipofectamine 2000 i komórki zebrano 24 godziny po transfekcji.Poziomy ekspresji FoxO1 i p27 w komórkach transfekowanych inhibitorami miR-21 porównano z poziomami w komórkach traktowanych egzosomami pochodzącymi z BV2 przy użyciu qRT-PCR (A, B).
Aby uniknąć odpowiedzi immunologicznej żywiciela, pasożyt Toxoplasma przekształca się w cystę tkankową.Pasożytują w różnych tkankach, w tym w mózgu, sercu i mięśniach szkieletowych, przez całe życie żywiciela i modulują jego odpowiedź immunologiczną.Ponadto mogą regulować cykl komórkowy i apoptozę komórek gospodarza, promując ich proliferację14,24.Toxoplasma gondii infekuje głównie komórki dendrytyczne gospodarza, neutrofile i linię monocytów/makrofagów, w tym mikroglej mózgu.Toxoplasma gondii indukuje różnicowanie makrofagów o fenotypie M2, wpływa na gojenie ran po zakażeniu patogenem, a także wiąże się z hiperwaskularyzacją i zwłóknieniem ziarniniakowym.Ta behawioralna patogeneza zakażenia Toxoplasma może być powiązana z markerami związanymi z rozwojem nowotworu.Wrogie środowisko regulowane przez Toxoplasmę może przypominać odpowiadający mu stan przedrakowy.Można zatem przypuszczać, że zakażenie Toxoplasma powinno przyczyniać się do rozwoju nowotworów mózgu.W rzeczywistości odnotowano wysoki wskaźnik infekcji Toxoplasma w surowicy pacjentów z różnymi nowotworami mózgu.Ponadto Toxoplasma gondii może być kolejnym czynnikiem rakotwórczym i działać synergistycznie, pomagając innym zakaźnym czynnikom rakotwórczym rozwinąć guzy mózgu.W związku z tym warto zauważyć, że P. falciparum i wirus Epsteina-Barra synergistycznie przyczyniają się do powstawania chłoniaka Burkitta.
Rola egzosomów jako regulatorów w badaniach nad nowotworami była szeroko badana.Jednakże rola egzosomów pomiędzy pasożytami a zakażonymi żywicielami pozostaje słabo poznana.Jak dotąd różne regulatory, w tym wydzielane białka, wyjaśniły procesy biologiczne, dzięki którym pierwotniaki pasożytnicze opierają się atakowi żywiciela i utrwalają infekcję.Ostatnio coraz większą popularnością cieszy się koncepcja, że ​​mikropęcherzyki związane z pierwotniakami i ich mikroRNA wchodzą w interakcję z komórkami gospodarza, tworząc sprzyjające środowisko dla ich przetrwania.Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby odkryć związek między zmienionymi egzosomalnymi miRNA a proliferacją komórek glejaka.Zmiany w mikroRNA (geny klastrowe miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 i miR-17-92) wiążą się z promotorem STAT3 w ludzkich makrofagach zakażonych toksoplazmą, są regulowane i indukują działanie antygenowe -apoptoza w odpowiedzi na infekcję Toxoplasma gondii 29 .Zakażenie Toxoplasma zwiększa ekspresję miR-17-5p i miR-106b-5p, które są powiązane z kilkoma chorobami hiperproliferacyjnymi 30 .Dane te sugerują, że miRNA gospodarza regulowane przez infekcję Toxoplasma są ważnymi cząsteczkami dla przeżycia pasożyta i patogenezy w biologicznym zachowaniu gospodarza.
Zmienione miRNA mogą wpływać na różne typy zachowań podczas inicjacji i progresji komórek złośliwych, w tym glejaków: samowystarczalność sygnałów wzrostu, niewrażliwość na sygnały hamujące wzrost, unikanie apoptozy, nieograniczony potencjał replikacyjny, angiogenezę, inwazję i przerzuty oraz zapalenie.W kilku badaniach profilowania ekspresji zidentyfikowano zmienione miRNA w glejaku.
W niniejszym badaniu potwierdziliśmy wysoki poziom ekspresji miRNA-21 w komórkach gospodarza zakażonych toksoplazmą.miR-21 zidentyfikowano jako jeden z najczęściej ulegających nadekspresji mikroRNA w guzach litych, w tym glejakach, 33 a jego ekspresja koreluje ze stopniem glejaka.Coraz liczniejsze dowody sugerują, że miR-21 jest nowym onkogenem, który działa jako czynnik antyapoptotyczny we wzroście glejaka i ulega silnej nadekspresji w tkankach i osoczu nowotworów ludzkiego mózgu.Co ciekawe, inaktywacja miR-21 w komórkach i tkankach glejaka powoduje hamowanie proliferacji komórek w wyniku apoptozy zależnej od kaspazy.Analiza bioinformatyczna przewidywanych celów miR-21 ujawniła wiele genów supresorowych nowotworu powiązanych ze szlakami apoptozy, w tym programowaną śmiercią komórki 4 (PDCD4), tropomiozyną (TPM1), PTEN i forkhead box O1 (FoxO1) z miejscem wiązania miR-2121..22.38.
FoxO1, jako jeden z czynników transkrypcyjnych (FoxO), bierze udział w rozwoju różnych typów nowotworów u ludzi i może regulować ekspresję genów supresorowych nowotworów, takich jak p21, p27, Bim i FasL40.FoxO1 może wiązać i aktywować inhibitory cyklu komórkowego, takie jak p27, w celu zahamowania wzrostu komórek.Co więcej, FoxO1 jest kluczowym efektorem sygnalizacji PI3K/Akt i reguluje wiele procesów biologicznych, takich jak progresja cyklu komórkowego i różnicowanie komórek poprzez aktywację transkrypcji p2742.
Podsumowując, wierzymy, że egzosomalny miR-21 pochodzący z mikrogleju zakażonego Toxoplasma może odgrywać ważną rolę jako regulator wzrostu komórek glejaka (ryc. 7).Jednakże potrzebne są dalsze badania, aby znaleźć bezpośredni związek między egzosomalnym miR-21, zmienioną infekcją Toxoplasma i wzrostem glejaka.Oczekuje się, że wyniki te staną się punktem wyjścia do badania związku pomiędzy zakażeniem Toxoplasma a występowaniem glejaka.
W tym badaniu zaproponowano schematyczny diagram mechanizmu karcynogenezy glejaka (mózgu).Autorka rysuje w programie PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Wszystkie protokoły eksperymentalne w tym badaniu, w tym z wykorzystaniem zwierząt, były zgodne ze standardowymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i komitetu użytkowników Uniwersytetu Narodowego w Seulu i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Szkoły Medycznej Narodowego Uniwersytetu w Seulu (numer IRB SNU- 150715).-2).Wszystkie procedury doświadczalne przeprowadzono zgodnie z zaleceniami ARRIVE.
Mysi mikroglej BV2 i ludzkie komórki glejaka U87 hodowano odpowiednio w pożywce Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seul, Korea) i pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), każda zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej, 4 mM l- glutamina, 0,2 mM penicylina i 0,05 mM streptomycyna.Komórki hodowano w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C.Do porównania z komórkami U87 wykorzystano inną linię komórkową glejaka, U118.
W celu wyizolowania egzosomów ze szczepów RH i ME49 zakażonych T. gondii, tachyzoity T. gondii (szczep RH) zebrano z jamy brzusznej 6-tygodniowych myszy BALB/c, którym wstrzyknięto 3-4 dni wcześniej.Tachyzoity przemyto trzykrotnie PBS i oczyszczono przez odwirowanie w 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.W celu uzyskania tachyzoitów szczepu ME49, myszom BALB/c wstrzyknięto dootrzewnowo 20 cyst tkankowych i zebrano transformację tachyzoitową w cystach poprzez przemycie jamy brzusznej 6-8 dnia po zakażeniu (PI).Myszy zakażone PBS.Tachyzoity ME49 hodowano w komórkach uzupełnionych 100 µg/ml penicyliny (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 µg/ml streptomycyny (Gibco/BRL) i 5% płodowej surowicy bydlęcej (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla.Po hodowli w komórkach Vero tachyzoity ME49 przepuszczono dwukrotnie przez igłę nr 25, a następnie przez filtr 5 µm w celu usunięcia zanieczyszczeń i komórek.Po przemyciu tachyzoity ponownie zawieszono w PBS44.Cysty tkankowe Toxoplasma gondii szczepu ME49 utrzymywano przez dootrzewnowe wstrzyknięcie cyst wyizolowanych z mózgu zakażonych myszy C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Mózgi myszy zakażonych ME49 zebrano po 3 miesiącach PI i rozdrobniono pod mikroskopem w celu wyizolowania cyst.Zakażone myszy trzymano w specjalnych warunkach wolnych od patogenów (SPF) w Szkole Medycznej Uniwersytetu Narodowego w Seulu.
Całkowity RNA ekstrahowano z egzosomów pochodzących z BV2, komórek i tkanek BV2 przy użyciu zestawu miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta, uwzględniając czas inkubacji dla etapu elucji.Stężenie RNA oznaczono za pomocą spektrofotometru NanoDrop 2000.Jakość mikromacierzy RNA oceniano za pomocą bioanalizatora Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Holandia).
DMEM z 10% FBS ubogim w egzosomy przygotowano przez ultrawirowanie przy 100 000 g przez 16 godzin w temperaturze 4°C i przesączono przez filtr 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).Komórki BV2, 5 x 105, hodowano w DMEM zawierającym 10% FBS zubożonego w egzosomy i 1% antybiotyków w temperaturze 37°C i 5% CO2.Po 24 godzinach inkubacji do komórek dodano tachyzoity szczepu RH lub ME49 (MOI = 10), a w ciągu godziny usunięto nieinwazyjne pasożyty i ponownie napełniono DMEM.Egzosomy z komórek BV2 izolowano metodą zmodyfikowanego wirowania różnicowego, najczęściej stosowaną metodą.Zawiesić ponownie osad egzosomu w 300 µl PBS do analizy RNA lub białka.Stężenie wyizolowanych egzosomów określono za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) i spektrofotometru NanoDrop 2000.
Osad z komórek BV2 lub egzosomów pochodzących z BV2 poddano lizie w roztworze do ekstrakcji białek PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea), a białka naniesiono na żele poliakryloamidowe Coomassie barwione błękitem brylantowym 10% SDS.Ponadto białka przenoszono na membrany PVDF na 2 godziny.Analizę Western blot sprawdzano przy użyciu przeciwciała Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) jako markera egzosomalnego.Jako przeciwciało drugorzędowe zastosowano kozie przeciwciało antymysie IgG sprzężone z HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, Teksas, USA) i LAS-1000 plus analizator obrazu luminescencyjnego (Fuji Photographic Film, Tokio, Japonia)..W celu zbadania wielkości i morfologii egzosomów przeprowadzono transmisyjną mikroskopię elektronową.Egzosomy wyizolowane z komórek BV2 (6,40 µg/µl) przygotowano na siatkach pokrytych węglem i barwiono negatywnie 2% octanem uranylu przez 1 minutę.Przygotowane próbki obserwowano przy napięciu przyspieszającym 80 kV przy użyciu aparatu JEOL 1200-EX II (Tokio, Japonia) wyposażonego w kamerę CCD Erlangshen ES1000W (Gatan, Pleasanton, Kalifornia, USA).
Egzosomy pochodzące z BV2 barwiono przy użyciu zestawu PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Komórki U87, 2x105, z egzosomami znakowanymi PKH26 (czerwone) lub bez egzosomów jako kontrola negatywna, inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godziny w inkubatorze z 5% CO2.Jądra komórkowe U87 barwiono DAPI (na niebiesko), komórki U87 utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez 15 minut w temperaturze 4°C, a następnie analizowano w systemie mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Niemcy).zauważalny.
cDNA zsyntetyzowano z siRNA przy użyciu syntezy pierwszej nici siRNA Mir-X i zestawu SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japonia).Ilościową PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu systemu detekcji PCR w czasie rzeczywistym iQ5 (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia, USA) przy użyciu starterów i matryc zmieszanych z SYBR Premix.DNA amplifikowano przez 40 cykli denaturacji w temperaturze 95°C przez 15 sekund i hybrydyzacji w temperaturze 60°C przez 60 sekund.Dane z każdej reakcji PCR analizowano przy użyciu modułu analizy danych oprogramowania systemu optycznego iQ™5 (Bio-Rad).Względne zmiany w ekspresji genów pomiędzy wybranymi genami docelowymi a β-aktyną/siRNA (i U6) obliczono przy użyciu metody krzywej standardowej.Zastosowane sekwencje starterów przedstawiono w Tabeli 1.
3 x 104 komórek glejaka U87 wysiano na 96-studzienkowe płytki i zmieszano z egzosomami zakażonymi Toxoplasma pochodzącymi z BV2 (50 µg/ml) lub egzosomami niepulsującymi pochodzącymi z BV2 (50 µg/ml) jako kontrole po 12, 18 i 36 godzinach .Szybkość proliferacji komórek określono przy użyciu zestawu Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonia) (rysunki uzupełniające S1-S3) 46 .
5-tygodniowe samice myszy BALB/c nude zakupiono od Orient Bio (Seongnam-si, Korea Południowa) i trzymano osobno w sterylnych klatkach w temperaturze pokojowej (22±2°C) i wilgotności (45±15°C).%) w temperaturze pokojowej (22±2°C) i wilgotności (45±15%).Przeprowadzono 12-godzinny cykl światła i 12-godzinny cykl ciemności pod SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Myszy podzielono losowo na trzy grupy po 5 myszy każda i wszystkim grupom wstrzyknięto podskórnie 400 ml PBS zawierającego 1 x 107 komórek glejaka U87 i BD Matrigel™ o zmniejszonym czynniku wzrostu (BD Science, Miami, Floryda, USA).Sześć dni po wstrzyknięciu guza w miejsce guza wstrzyknięto 200 mg egzosomów pochodzących z komórek BV2 (z infekcją Toxoplasma lub bez niej).Dwadzieścia dwa dni po zakażeniu nowotworem, wielkość guza myszy w każdej grupie mierzono za pomocą suwmiarki trzy razy w tygodniu, a objętość guza obliczano ze wzoru: 0,5 x (szerokość) x 2 x długość.
Analiza ekspresji mikroRNA przy użyciu macierzy miRNA miRCURYTM LNA, 7. generacji, obejmuje macierze mmu i rno (EXIQON, Vedbaek, Dania) obejmujące 1119 dobrze scharakteryzowanych myszy spośród 3100 sond wychwytujących miRNA ludzi, myszy i szczurów.Podczas tej procedury z 5′-fosforanu usunięto 250 do 1000 ng całkowitego RNA poprzez działanie fosfatazą alkaliczną z jelita cielęcego, a następnie znakowanie zielonym barwnikiem fluorescencyjnym Hy3.Znakowane próbki następnie hybrydyzowano poprzez załadowanie szkiełek mikromacierzy przy użyciu zestawu komory hybrydyzacyjnej (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA) i zestawu szkiełek hybrydyzacyjnych (Agilent Technologies).Hybrydyzację prowadzono przez 16 godzin w temperaturze 56°C, następnie mikromacierze przemyto zgodnie z zaleceniami producenta.Przetworzone szkiełka mikromacierzy następnie skanowano przy użyciu systemu skanera mikromacierzy Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Zeskanowane obrazy importowano przy użyciu oprogramowania Agilent Feature Extraction w wersji 10.7.3.1 (Agilent Technologies), a intensywność fluorescencji każdego obrazu określano ilościowo przy użyciu odpowiedniego pliku GAL zmodyfikowanego protokołu Exiqon.Dane mikromacierzy dla bieżącego badania są zdeponowane w bazie danych GEO pod numerem dostępu GPL32397.
Profile ekspresji dojrzałych egzosomalnych miRNA w mikrogleju szczepów RH lub ME49 zakażonych Toxoplasma analizowano przy użyciu różnych narzędzi sieciowych.miRNA związane z rozwojem nowotworu zidentyfikowano za pomocą miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) i odfiltrowano przy znormalizowanej intensywności sygnału (log2) większej niż 8,0.Stwierdzono, że wśród miRNA miRNA ulegające zróżnicowanej ekspresji są ponad 1,5-krotnie zmienione na podstawie analizy filtracyjnej miRNA zmienionych przez szczepy RH lub ME49 zakażone T. gondii.
Komórki wysiano na sześciostudzienkowe płytki (3 x 105 komórek/studzienkę) w opti-MEM (Gibco, Carlsbad, Kalifornia, USA) przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Transfekowane komórki hodowano przez 6 godzin, a następnie pożywkę zmieniono na świeżą, pełną pożywkę.Komórki zebrano 24 godziny po transfekcji.
Analizę statystyczną przeprowadzono głównie za pomocą testu t-Studenta z oprogramowaniem Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Do eksperymentalnej analizy zwierząt przeprowadzono dwukierunkową analizę ANOVA przy użyciu oprogramowania Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornia, USA). Wartości P < 0,05 uznano za istotne statystycznie. Wartości P < 0,05 uznano za istotne statystycznie. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Wartości P <0,05 uznano za istotne statystycznie. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P < 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Wartości P <0,05 uznano za istotne statystycznie.
Wszystkie protokoły eksperymentalne zastosowane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Szkoły Medycznej Uniwersytetu Narodowego w Seulu (numer IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. i in.Szacowana globalna zapadalność i umieralność na nowotwory w 2018 roku: źródła i metody GLOBOCAN.Interpretacja.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS Wgląd w czynniki ryzyka nowotworów mózgu i ich interwencje terapeutyczne. Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS Wgląd w czynniki ryzyka nowotworów mózgu i ich interwencje terapeutyczne.Rashid, S., Rehman, K. i Akash, MS Przegląd czynników ryzyka nowotworów mózgu i głównych interwencji terapeutycznych. Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS. Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS Głębokie zrozumienie czynników ryzyka nowotworu mózgu i interwencji terapeutycznych.Rashid, S., Rehman, K. i Akash, MS Przegląd czynników ryzyka nowotworów mózgu i głównych interwencji terapeutycznych.Nauka biomedyczna.Farmaceuta.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. i Sun, J. Interakcje bakterio-wirusowe w ludzkich rakach przewodu pokarmowego i żeńskich narządów płciowych: podsumowanie dowodów epidemiologicznych i laboratoryjnych. Kato, I., Zhang, J. i Sun, J. Interakcje bakterio-wirusowe w ludzkich rakach przewodu pokarmowego i żeńskich narządów płciowych: podsumowanie dowodów epidemiologicznych i laboratoryjnych.Kato I., Zhang J. i Sun J. Interakcje bakterio-wirusowe w raku ludzkiego przewodu pokarmowego i żeńskich narządów płciowych: podsumowanie danych epidemiologicznych i laboratoryjnych. Kato, I., Zhang, J. i Sun, J.人类口腔消化道癌和女性生殖道癌中的细菌-病毒相互作用:流行病学和实验室证据总结。 Kato, I., Zhang, J. i Sun, J. Interakcja bakterio-wirusowa w trawieniu ludzkiej jamy ustnej i żeńskim układzie rozrodczym: podsumowanie popularnej nauki o chorobach i dowodów laboratoryjnych.Kato I., Zhang J. i Sun J. Interakcje bakterio-wirusowe w raku przewodu pokarmowego u ludzi i raku żeńskich narządów płciowych: podsumowanie danych epidemiologicznych i laboratoryjnych.Rak 14, 425 (2022).
Magon, KL i Parish, JL Od infekcji do raka: jak wirusy nowotworowe DNA zmieniają centralny metabolizm węgla i lipidów w komórce gospodarza. Magon, KL i Parish, JL Od infekcji do raka: jak wirusy nowotworowe DNA zmieniają centralny metabolizm węgla i lipidów w komórce gospodarza.Mahon, KL i Parish, JL Zakażenie ogniem raka: w jaki sposób wirusy nowotworowe oparte na DNA zmieniają centralny metabolizm węgla i lipidów w komórce gospodarza. Magon, KL & Parish, JL Dane źródłowe: DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢. Magon, KL i Parish, JL Od infekcji do raka: jak wirusy nowotworowe DNA zmieniają centralny metabolizm węgla i lipidów w komórce gospodarza.Mahon, KL i Parish, JL Zakażenie ogniem na raka: jak wirusy nowotworowe DNA zmieniają centralny metabolizm węgla i lipidów w komórkach gospodarza.Otwarta biologia.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM i in.Estrogeny katecholowe schistosomów i przywry wątrobowej oraz raka związanego z robakami pasożytniczymi.przód.gorąco w środku.5, 444 (2014).