Giardia duodenum to organizm pasożytniczy wywołujący lambliozę – infekcję jelitową, szczególnie częstą u małych dzieci z klinicznymi objawami biegunki.Wcześniej informowaliśmy, że zewnątrzkomórkowy G. duodenalis wyzwala aktywację nukleotydów wiążących wewnątrzkomórkowy receptor podobny do oligomeryzacji 3 (NLRP3) i reguluje reakcje zapalne gospodarza poprzez wydzielanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).Jednakże dokładne wzorce molekularne związanej z patogenem dwunastnicy EV (GEV) zaangażowanej w ten proces oraz rola inflamasomu NLRP3 w giardiozie pozostają do wyjaśnienia.
Skonstruowano rekombinowane eukariotyczne plazmidy ekspresyjne pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardyny w GEV, transfekowano do pierwotnych makrofagów otrzewnowych myszy i wykrywano poprzez pomiar docelowej cząsteczki zapalenia, kaspazy-1.Przeszukano poziom ekspresji p20..Giardyny alfa-2 i alfa-7.3 z G. duodenalis pierwotnie zidentyfikowano poprzez pomiar inflamasomu NLRP3 (NLRP3, pro-interleukiny-1 beta [IL-1β], prokaspazy-1 i kaspazy-1 p20) oraz wydzielania IL.poziomy 1β, poziomy oligomeryzacji apoptotycznego białka plamistego (ASC) i immunofluorescencyjna lokalizacja NLRP3 i ASC.Następnie oceniano rolę inflamasomu NLRP3 w patogeniczności G. duodenalis przy użyciu myszy, u których aktywacja NLRP3 była zablokowana (myszy z blokadą NLRP3) i monitorowano patologiczne zmiany w masie ciała, obciążeniu pasożytami dwunastnicy i tkance dwunastnicy.Ponadto zbadaliśmy, czy hiardyny alfa-2 i alfa-7.3 indukują wydzielanie IL-1β in vivo poprzez inflamasom NLRP3 i określiliśmy rolę tych cząsteczek w patogeniczności G. duodenalis u myszy.
Giardyny alfa-2 i alfa-7.3 indukują aktywację inflamasomu NLRP3 in vitro.Doprowadziło to do aktywacji kaspazy-1 p20, wzrostu poziomu ekspresji białek NLRP3, pro-IL-1β i prokaspazy-1, znacznego wzrostu wydzielania IL-1β, powstania plamek ASA w cytoplazmę i indukcję oligomeryzacji ASA.Zapalenie NLRP3 Utrata prącia zaostrza patogeniczność G. duodenalis u myszy.Myszy leczone cystami przez zgłębnik od myszy z blokadą NLRP3 wykazywały zwiększoną liczbę trofozoitów i poważne uszkodzenie kosmków dwunastnicy, charakteryzujące się martwiczymi kryptami ze skurczonymi i rozgałęzionymi.Doświadczenia in vivo wykazały, że giardyny alfa-2 i alfa-7.3 mogą indukować wydzielanie IL-1β poprzez inflammasom NLRP3, a immunizacja giardynami alfa-2 i alfa-7.3 zmniejszyła patogenność G. duodenalis u myszy.
Podsumowując, wyniki tego badania sugerują, że giardia alfa-2 i alfa-7.3 powodują regulację w górę stanu zapalnego NLRP3 gospodarza i zmniejszają zakaźność G. duodenalis u myszy, które są obiecującymi celami w zapobieganiu giardiozie.
Giardia duodenum jest zewnątrzkomórkowym pierwotniakiem żyjącym w jelicie cienkim i powodującym 280 milionów przypadków lambliozy z biegunką rocznie, zwłaszcza wśród małych dzieci w krajach rozwijających się [1].Do zakażenia dochodzi poprzez wypicie wody lub pożywienia skażonego cystami M. dwunastnicy, które następnie dostają się do żołądka i są wydalane z sokami żołądkowymi.Trofozoity Giardia duodenum przyczepiają się do nabłonka dwunastnicy, powodując nudności, wymioty, biegunkę, ból brzucha i utratę wagi.Osoby z niedoborami odporności i mukowiscydozą są podatne na infekcję.Do zakażenia może dojść także podczas seksu oralnego i analnego [2].Preferowanymi metodami leczenia infekcji dwunastnicy są leki takie jak metronidazol, tinidazol i nitazoksanid [3].Jednakże te leki stosowane w chemioterapii powodują niekorzystne skutki uboczne, takie jak nudności, karcynogeneza i genotoksyczność [4].Dlatego należy opracować skuteczniejsze strategie zapobiegania zakażeniu G. duodenalis.
Inflammasomy to klasa cytozolowych kompleksów białkowych, które biorą udział w wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, pomagając w obronie przed inwazją patogenów i pośrednicząc w odpowiedziach zapalnych [5].Wśród tych inflammasomów szeroko badano inflamasom wiążący nukleotydy oligomeryzacji (NOD) receptor 3 (NLRP3) oligomeryzacji wiążącej nukleotydy (NLRP3), ponieważ można go wykryć za pomocą różnych wzorców molekularnych związanych z patogenami/uszkodzeniami (PAMP/ DAMP), rozpoznaje, aktywuje wrodzony układ odpornościowy.oraz reguluje homeostazę jelitową w wielu chorobach zapalnych [6,7,8].Składa się z receptora rozpoznawania wzorców (PRR) NLRP3, adaptorowego białka plamistego apoptotycznego (ASC) i efektorowej prokaspazy-1 lub prokaspazy-11.Inflamasom NLRP3 działa jako gospodarz przeciwko inwazji patogenów, co zaobserwowano w badaniach Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] i Leishmania.[11], ale donoszono również, że aktywacja inflammasomu NLRP3 ogranicza ochronne odpowiedzi immunologiczne i zaostrza postęp choroby, np. u robaków [12].W oparciu o nasze wcześniejsze ustalenia donieśliśmy, że zewnątrzkomórkowy G. duodenalis wyzwala wewnątrzkomórkową aktywację zapalenia NLRP3 i moduluje odpowiedź zapalną gospodarza poprzez wydzielanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) [13].Jednakże rola inflamasomu NLRP3 w zakażeniu G. duodenalis in vivo pozostaje do ustalenia.
Giardyny zostały pierwotnie opisane jako elementy strukturalne cytoszkieletu G. duodenalis i odgrywają ważną rolę w ruchliwości trofozoitów i przyłączaniu komórek nabłonkowych w jelicie cienkim.Aby lepiej przystosować się do środowiska i zwiększyć swoją patogeniczność, trofozoity G. duodenalis rozwinęły unikalną strukturę cytoszkieletu składającą się z 8 wici, 1 trzonu środkowego i 1 krążka brzusznego [14].Trofozoity Giardia duodenum wykorzystują swój cytoszkielet do penetracji górnej części jelita cienkiego, zwłaszcza dwunastnicy, i przyłączają się do enterocytów.Stale migrują i przyczepiają się do komórek nabłonkowych za pomocą metabolizmu komórkowego.Dlatego istnieje ścisły związek między ich cytoszkieletem a zjadliwością.Giardyny specyficzne dla Giardia duodenum są składnikami struktury cytoszkieletu [15] i dzielą się na cztery klasy: α-, β-, γ- i δ-giardyny.Istnieje 21 członków rodziny α-giardyn, z których wszystkie mają zależną od wapnia zdolność wiązania fosfolipidów [16].Łączą także cytoszkielet z błoną komórkową.U osób z biegunką wywołaną przez G. duodenalis α-giardyny ulegają silnej ekspresji i wykazują immunoreaktywność podczas infekcji [17].Heterologiczne szczepionki oparte na Giardia alfa-1 chronią przed lambliozą u myszy i są potencjalnymi antygenami kandydującymi do opracowania szczepionki [18].Giardyna alfa-8, zlokalizowana w błonie komórkowej i wici, ale nie w krążku brzusznym, zwiększa ruchliwość i tempo wzrostu trofozoitów u G. duodenalis [19].Giardyna alfa-14 przyłącza się do struktur mikrotubul na wici i wpływa na żywotność G. duodenalis [20].Giardyna alfa-11 jest obecna w dużych ilościach przez cały cykl życiowy, a nadekspresja giardyny alfa-11 uszkadza samą G. duodenalis [21].Nie jest jednak jasne, czy giardyna alfa-2 i giardyna alfa-7.3 chronią przed infekcją G. duodenalis i mechanizmami leżącymi u jej podstaw.
W tym badaniu rekombinowane eukariotyczne plazmidy ekspresyjne pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardyna i pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardyna transfekowano do pierwotnych makrofagów otrzewnowych myszy w celu aktywacji NLRP3 gospodarza.Następnie przeszukano cele inflamasomowe.Oceniliśmy także rolę inflamasomu NLRP3 w patogeniczności G. duodenalis, zbadaliśmy, czy giardyny alfa-2 i alfa-7,3 indukują aktywację inflamasomu NLRP3 in vivo i ustaliliśmy, że te dwie role giardyn w patogeniczności G. dwunastnicy.Naszym wspólnym celem było opracowanie obiecujących celów w zakresie zapobiegania zakażeniom G. duodenalis.
Samice myszy C57BL/6 typu dzikiego (WT) w wieku 5–8 tygodni zakupiono w Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Chiny).Myszy miały swobodny dostęp do wody, otrzymywały sterylną żywność i trzymano je w 12/12-godzinnym cyklu światło/ciemność.Przed infekcją myszy otrzymywały antybiotyki ad libitum w wodzie pitnej uzupełnione ampicyliną (1 mg/ml), wankomycyną (1 mg/ml) i neomycyną (1,4 mg/ml) (wszystkie zakupione w Szanghaju w Chinach, sztuczne organizmy) [22 ]]Myszy, które utraciły zdolność jedzenia i picia na > 24 godziny i straciły ≥ 20% masy ciała, zostały humanitarnie uśmiercone poprzez zwichnięcie odcinka szyjnego.
Trofozoity WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, USA) uzupełniono 12,5% płodową surowicą bydlęcą (FBS; Every Green, Zhejiang, Chiny) i 0,1% żółcią bydlęcą (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA ).USA) w warunkach mikrotlenowych.Zlewające się trofozoity zebrano na lodzie i pasażowano w stosunku 1:4 w celu dalszej reprodukcji.
Cysty Giardia dwunastnicy indukowano w sposób opisany wcześniej [23], trofozoity zbierano w fazie logarytmicznej, a następnie rozcieńczano pożywką indukującą kapsułkowanie, pH 7,1 (modyfikowany TYI-S-33) do końcowego stężenia 1 × 106 trofozoitów/ml.stężenie żółci 0,05% pożywki).Trofozoity hodowano w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C aż do logarytmicznej fazy wzrostu.Zmienić podłoże na podłoże indukujące cysty (pH 7,8; modyfikowane podłoże TYI-S-33 o stężeniu żółci 1%) i hodować G. duodenalis w temperaturze 37°C przez 48–96 godzin, podczas których obserwowano pod mikroskopem powstawanie cyst.Po tym, jak większość trofozoitów została pobudzona do utworzenia cyst, mieszaninę hodowli zebrano i ponownie zawieszono w sterylnej dejonizowanej wodzie w celu lizy pozostałych trofozoitów.Cysty zliczano i przechowywano w temperaturze 4°C do kolejnych analiz przez sondę żołądkową u myszy.
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe Giardia (GEV) wzbogacono w sposób opisany wcześniej [13].Trofozoity w logarytmicznej fazie wzrostu ponownie zawieszono w zmodyfikowanej pożywce TYI-S-33 przygotowanej z FBS zubożonym w egzosomy (Biological Industries, Beit-Haemek, Izrael) do końcowego stężenia 1 × 106 pasożytów/ml i inkubowano przez 12 godzin.wyizolowano z supernatantu hodowli przez wirowanie przy 2000 g przez 10 minut, 10 000 g przez 45 minut i 100 000 g przez 60 minut.Osad rozpuszczono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu do oznaczania białka BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) i przechowywano w temperaturze -80°C lub wykorzystano bezpośrednio do dalszych analiz.
Pierwotne mysie makrofagi otrzewnowe przygotowano w sposób opisany wcześniej [24].W skrócie, myszom (w wieku 6-8 tygodni) wstrzyknięto (dootrzewnowo [ip]) 2,5 ml płynnej pożywki tioglikolowej o stężeniu 2,98% Difco (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) i karmiono 3-4 podniebienia.Zawiesinę makrofagów pobrano z jamy brzusznej myszy po eutanazji i wirowano 3 razy przy 1000 g przez 10 minut.Zebrane komórki wykrywano metodą cytometrii przepływowej przy użyciu markera CD11b, aż czystość komórek wynosiła > 98%, następnie dodawano do 6-studzienkowych płytek do hodowli komórkowej (4,5 x 106 komórek/studzienkę) i inkubowano z 10% FBS (Bioindustry) w temperaturze 37°C.i 5% CO2.
RNA ekstrahowano z 1 × 107 trofozoitów w 1 ml odczynnika TRIzol (Vazyme, Nanjing, Chiny), genomowy DNA ekstrahowano z całkowitego RNA G. duodenalis przy użyciu dsDNazy MonScript (Monad, Wuhan, Chiny) i zsyntetyzowano komplementarny DNA (cDNA) stosując MonScript RTIIII Super Mix (Monad) zgodnie z instrukcją producenta.
Informacje o sekwencji CDS dla docelowego genu G. duodenalis uzyskano z NCBI GenBank.Użyj Primer 5.0 do zaprojektowania specyficznych, płynnych starterów do klonowania dla każdego docelowego genu.Starter do przodu (5′-3′) składa się z trzech części: nakładającej się sekwencji z linearyzowanym wektorem pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) i kodonami start ATG i GNN (jeśli pierwszą zasadą nie jest G).Ma to na celu poprawę efektywności ekspresji.Dodatkowo co najmniej 16 bp połączonych zasad (zawartość GC 40–60%/Tm ok. 55°C).Starter odwrotny (5′-3′) składa się z dwóch części, nakładającej się sekwencji z linearyzowanym EcoRV wektorem pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) i połączonej zasady o długości co najmniej 16 bp.(z wyłączeniem dwóch ostatnich przystanków).zasady) kodon, taki jak AA lub GA, aby umożliwić rekombinowanym plazmidom ekspresję ich znakowanych białek).Sekwencje starterów wymieniono w Tabeli 1 i zostały zsyntetyzowane przez Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Chiny).
Cele amplifikowano przy użyciu polimerazy DNA Pfu (Tiangen, Pekin, Chiny) lub Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Pekin, Chiny), stosując przygotowany cDNA G. duodenalis jako matrycę.Plazmid eukariotycznego wektora ekspresyjnego pcDNA3.1(+) linearyzowano enzymem restrykcyjnym EcoRV i defosforylowano przy użyciu Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linearyzowane fragmenty pcDNA3.1(+) i amplifikowane fragmenty genów docelowych oczyszczono przy użyciu zestawu do oczyszczania w żelu DNA (Tiangen) i oznaczono ilościowo przy użyciu Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragment pcDNA3.1(+) i każdy fragment genu docelowego rekombinowano przy użyciu mieszanki do klonowania pojedynczego złożenia MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Chiny) i potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA przy użyciu Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Chiny)..
Plazmidy wolne od endotoksyn pcDNA3.1(+)-alfa-2 i pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 wygenerowano przy użyciu zestawu SanPrep Endotoxin Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Stężenie utrzymywano powyżej 500 ng/µl, aby mieć pewność, że EDTA w buforze do elucji nie zakłóca testu transfekcji.Pierwotne mysie makrofagi otrzewnowe hodowano na 6-studzienkowych płytkach z pełną pożywką RPMI 1640 (Biological Industries) przez 12 godzin, następnie komórki przemyto 3 razy w ciepłym PBS w celu usunięcia penicyliny i streptomycyny, a następnie w pożywce uzupełnionej pożywką pełną.Plazmidy wolne od endotoksyn pcDNA3.1(+)-alfa-2 i pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2,5 µg) rozcieńczono w 125 µl pożywki o obniżonej zawartości surowicy Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Następnie 5 µl odczynnika do transfekcji Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) rozcieńczono w 125 µl pożywki Opti-MEM o niskiej zawartości surowicy.Przygotować kompleksy liposom-DNA mieszając rozcieńczony, wolny od endotoksyn plazmid z Lipofectamine 2000 i pozostawiając mieszaninę w temperaturze pokojowej na 5 minut.Przenieść kompleksy oddzielnie do komórek w każdym dołku i powoli mieszać.Po 4 godzinach pożywkę do hodowli komórkowej zastąpiono 2 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 i hodowlę kontynuowano przez 24 godziny.Do komórek dodano świeżą pożywkę do hodowli komórkowej i inkubowano przez różne punkty czasowe, w zależności od projektu testu.
Próbki białek z supernatantów i lizatów komórkowych przygotowano w sposób opisany wcześniej [25].Parametry transferu błonowego dla pro-IL-1β, prokaspazy-1, kaspazy-1 p20, NLRP3, β-aktyny i His-tag wynosiły 200 mA/90 min.Dla interleukiny 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), kaspazy-1 (p20) (Adipogen, Szwajcaria) i NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Szwajcaria) i 1:5000 ukierunkowanych na His tag (Amylet Scientific, Wuhan, Chiny) i β-aktyną (Proteintech, Wuhan, Chiny).
Sieciowanie suberanianem diukcynoimidu (DSS) przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [26].Komórki przemyto 3 razy zimnym PBS i poddano całkowitej lizie za pomocą igły nr 27 w 50 µl buforu reakcyjnego ASC (pH 8,0) zawierającego 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES i 125 mM NaHCO3.Mieszaninę odwirowano przy 5000 g przez 3 minuty, a osad zszyto z 10 µl DSS (25 mM w DMSO) i 40 µl buforu reakcyjnego ASC przez 30 minut w temperaturze 37°C.Po wirowaniu przy 5000 g przez 10 min, osad rozpuszczono w roztworze 40 µl buforu reakcyjnego ASC i 10 µl 6x buforu do obciążania białkiem (TransGen, Pekin, Chiny), a następnie roztwór schładzano w temperaturze pokojowej przez 15 min., Następnie gotuj 10 minut.Próbki białek poddano następnie analizie Western blot przy użyciu pierwszorzędowych przeciwciał anty-ASC (Wanleibio, Shenyang, Chiny) w stosunku rozcieńczenia 1:500.
Zgodnie z wcześniej opisaną procedurą [13] zebrano supernatanty hodowli komórkowych i oznaczono wydzielanie prozapalnej cytokiny IL-1β za pomocą zestawu mysiego IL-1 Beta ELISA (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Przelicz wartości OD450nm na stężenia białek, korzystając z krzywej standardowej IL-1β.
Komórki pokryte na szkiełkach nakrywkowych delikatnie przemyto 3 razy ciepłym PBS, utrwalono w utrwalaczu komórek tkankowych (Biosharp, Pekin, Chiny) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), w 0,1% Triton X-Permeabilize w 100 (rozcieńczony w PBS; Biosharp ) przez 20 minut w temperaturze pokojowej i blokować w 5% albuminie surowicy bydlęcej (w PBS) na 2 godziny w temperaturze pokojowej.Komórki następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z pierwotnymi przeciwciałami odpowiednio przeciwko ASC (rozcieńczenie 1:100) lub NLRP3 (rozcieńczenie 1:100) i znakowaną Cy3 kozą anty-króliczą IgG(H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, Kalifornia, USA) lub koziego anty-mysiego IgG skoniugowanego z FITC (1:400; Earthox) przez noc w temperaturze 37°C w ciemności przez 1 godzinę.Jądra barwiono Hoechst 33258 (10 µg/ml; UE, Suzhou, Chiny) przez 5 minut i obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym (Olympus Corporation, Tokio, Japonia).
Myszy podzielono na cztery grupy (n = 7 w każdej grupie): (i) grupa kontroli negatywnej traktowana PBS (tylko PBS; podawanie przez zgłębnik 100 µl/mysz PBS, a następnie codzienne wstrzyknięcie dootrzewnowe 100 µl/mysz PBS 3 godziny później)., nieprzerwanie przez 7 dni);(ii) grupa kontroli negatywnej leczona inhibitorem MCC950 [27] (100 µl/mysz przez zgłębnik PBS, 3 godziny później, 10 mg/kg masy ciała [mc.] MCC950 [w PBS] podawano codziennie dootrzewnowo, czas trwania 7 dni);(iii) Grupa zakażona cystą G. duodenalis (1,5 x 106 cyst/mysz przez zgłębnik, 3 godziny później, 100 µl/mysz PBS podawane dootrzewnowo codziennie przez 7 dni);(iv) Grupa zakażona cystą G. duodenalis, grupa leczona inhibitorem MCC950 (1,5 x 106 cyst/mysz przez zgłębnik, 10 mg/kg masy ciała MCC950 dootrzewnowo codziennie przez 7 dni po 3 godz.).Masę ciała każdej myszy monitorowano codziennie i wszystkie myszy poddano eutanazji siódmego dnia.Pobraną dwunastnicę (o długości 3 cm) pocięto na małe kawałki w 1 ml PBS, cysty zniszczono przez noc w PBS w temperaturze 4°C i trofozoity G. duodenalis.Wyizolowano świeżą dwunastnicę (o długości 1 cm) do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E).
Myszy podzielono na dwie grupy: (i) grupę kontrolną MOCK i (ii) grupę inhibitorów MCC950.W każdej grupie było pięć terapii (n = 7/grupa terapeutyczna): (i) grupa kontrolna ujemna traktowana PBS (tylko PBS; 100 µl/mysz PBS, wstrzyknięcie domięśniowe (IM) (mięsień piszczelowy przedni) [28, 29] ;( ii) grupa kontrolna ujemna z plazmidem pcDNA3.1(+) (100 µg/mysz DNA, poprzez wstrzyknięcie domięśniowe); (iii) grupa kontrolna z dodatnim zakażeniem cystą G. duodenalis (1,5 x 106 cyst/mysz, przez zgłębnik) (iv) a grupa leczona plazmidem pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 µg/mysz DNA, przez wstrzyknięcie domięśniowe) i (v) grupa leczona plazmidem pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/mysz DNA, po 12 godzinach pasażu, myszy w grupie otrzymującej inhibitor MCC950 otrzymywały codzienny dootrzewnowy zastrzyk MCC950 (10 mg/kg masy ciała) przez 7 dni, podczas gdy myszy w grupie MOCK otrzymywały równą objętość leczenia PBS. Próbki krwi pobierano pobrano od myszy z gałkami ocznymi i pozostawiono na noc w temperaturze 4°C. Próbki surowicy izolowano przy użyciu testu immunoenzymatycznego (ELISA) i pomiarów poziomów IL-1β.
Trzydzieści pięć myszy podzielono na pięć grup (n=7/grupę).Grupa 1 była grupą kontroli negatywnej leczonej PBS: myszy otrzymały 100 µl PBS domięśniowo i 3 dni później przez zgłębnik.Grupa 2 to pozytywna grupa kontrolna zakażona cystami G. duodenalis: myszom wstrzyknięto 100 µl PBS, a 3 dni później wstrzyknięto dożołądkowo 1,5 x 106 cyst/mysz.Grupa trzecia – immunizacja plazmidowa pcDNA3.1(+) w połączeniu z grupą kontrolną pod kątem zakażenia torbieli dwunastnicy: myszy otrzymały 100 µg plazmidowego DNA pcDNA3.1(+)(im) doustnie, 1,5×106 cyst/mysz 3 przez kilka dni.Grupy 4 i 5 obejmowały rekombinowany plazmid giardyny pcDNA3.1(+)-alfa-2 lub plazmid giardyny pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 w połączeniu z infekcją cystą G. duodenalis.Grupa eksperymentalna: myszy otrzymały 100 µg pcDNA3.DNA plazmidu 1(+)-giardyny (im), a następnie 3 dni później wstrzyknięto przez zgłębnik 1,5 x 106 cyst/mysz.Masę ciała każdej myszy monitorowano po wprowadzeniu cysty G. duodenalis przez rurkę.Pobrano świeżą dwunastnicę w celu pomiaru obciążenia pasożytami i analizy barwienia HE.
Zmiany histopatologiczne analizowano zgodnie z opublikowaną wcześniej procedurą [30].Świeżą dwunastnicę utrwalono środkiem utrwalającym komórki tkankowe, zatopiono w parafinie, pocięto na skrawki o wielkości 4 µm, wybarwiono H&E i analizowano pod mikroskopem świetlnym.Reprezentatywne zmiany patologiczne w siedmiu skrawkach tkanek od siedmiu niezależnych myszy zostały ocenione przez patologa nieświadomego leczenia i uchwycone przy powiększeniu 200x.Długość kosmków i głębokość krypt mierzono zgodnie z wcześniej opisanymi metodami.
Wyniki in vitro i in vivo uzyskano w trzech powtórzeniach.Wykresy wygenerowano przy użyciu programu GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornia, USA).Różnice między dwiema grupami analizowano za pomocą testu t, natomiast różnice między ≥3 grupami analizowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) przy użyciu oprogramowania SPSS (wersja 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Dane analizowano pod kątem jednorodności wariancji, stosując test Levene’a, a następnie test post hoc Bonferroniego (B).Istotność wyrażono jako P<0,05, P<0,01 i P<0,001 (nieistotne [ns]) (P>0,05).
Nasza poprzednia analiza proteomiki GEV w Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) wykazała, że wiele celów może być zaangażowanych w aktywację szlaków sygnalizacji stanu zapalnego [13].Wybraliśmy dwa obiecujące cele, giardyny alfa-2 i alfa-7.3, amplifikujemy te cząsteczki i wykorzystujemy je do skonstruowania eukariotycznego wektora ekspresyjnego pcDNA3.1(+).Po sekwencjonowaniu, rekombinowane plazmidy ekspresyjne pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardyny transfekowano do pierwotnych makrofagów otrzewnowych myszy i zidentyfikowano białko sygnaturowe kaspazy-1 p20 zapalenia (fragment aktywowanej kaspazy-1). jako wyjaśnienie kluczowych cząsteczek, które mogą wywołać stan zapalny.Wyniki wykazały, że giardyny alfa-2 i alfa-7.3 mogą indukować ekspresję kaspazy p20-1 podobną do GEV.Nie stwierdzono wpływu na aktywację kaspazy-1 w nietraktowanej kontroli negatywnej (tylko PBS) i kontroli plazmidowej pcDNA3.1(+) (Figura 1).
Pomiar aktywacji kaspazy p20-1 przez giardyny pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3.Rekombinowane eukariotyczne plazmidy ekspresyjne pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardyny (powyżej każdej ścieżki) transfekowano do pierwotnych mysich makrofagów otrzewnowych i supernatanty hodowli zebrano 24 godziny później.Do pomiaru poziomów ekspresji charakterystycznego białka inflammasomu kaspazy-1 p20 zastosowano analizę Western.Grupę leczoną wyłącznie PBS (ścieżka C) i grupę leczoną pcDNA3.1(+) w monoterapii (ścieżka pcDNA3.1) zastosowano jako kontrolę ujemną, a grupę leczoną GEV zastosowano jako kontrolę pozytywną.Ekspresję rekombinowanego białka potwierdzono przez wykrycie znacznika histydynowego w każdym białku, a oczekiwanymi prążkami białka były giardyna alfa-2 (38,2 kDa) i giardyna alfa-7,3 (37,2 kDa).GEV, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), wektor linearyzowany EcoRV, SUP, supernatant
Aby określić, czy giardyna alfa-2 i giardina alfa-7.3 indukują ekspresję kaspazy-1 p20 i odgrywają rolę w aktywacji odpowiedzi zapalnej gospodarza NLRP3, giardyny pcDNA3.1(+)-alfa-2 i pcDNA3.1(+)-alfa Giardynę -7.3 transfekowano do pierwotnych mysich makrofagów otrzewnowych za pomocą rekombinowanego plazmidowego DNA i określono poziomy ekspresji, lokalizacji i oligomeryzacji kluczowych białek zapalnych NLRP3.W tym eksperymencie GEV zastosowano jako grupę kontroli pozytywnej, a grupę nietraktowaną (tylko PBS) lub grupę poddaną transfekcji pcDNA3.1(+) stanowiła grupa ujemna.Wyniki pokazały, że podobnie jak w grupie GEV, rekombinowany plazmidowy DNA giardyny pcDNA3.1(+)-alfa-2 i giardyny pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 spowodował zwiększenie ekspresji NLRP3, pro-IL-1β i Aktywacja prokaspazy-1 i kaspazy-1 (ryc. 2a).Ponadto obie giardyny indukowały znaczące wydzielanie IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardyny: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;giardyna alfa-7,3: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Rysunek 2b).Większość białek ASC była monomeryczna w grupie nieleczonej lub w grupie leczonej transfekowanej plazmidem pcDNA3.1(+), w przeciwieństwie do pcDNA3.1(+)-alfa-2 lub pcDNA3.1(+)-alfa- 7,3 giardyny.Oligomeryzacja ASC wystąpiła w rekombinowanym plazmidowym DNA grupy lub grupy kontroli pozytywnej GEV, wykazując postać oligomeryczną (Figura 2c).Te wstępne dane sugerują, że giardyna alfa-2 i giardyna alfa-7,3 mogą indukować aktywację zapalenia NLRP3.Późniejsze badania immunofluorescencyjne lokalizacji ASC i NLRP3 wykazały, że w grupie kontroli negatywnej białko ASC było rozproszone w cytoplazmie i pojawiało się jako sygnał punktowy po stymulacji pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardyną lub pcDNA3.Grupa 1(+)-alfa-7,3 giardyny lub grupa kontrolna pozytywna GEV (Figura 2d).W grupach kontroli negatywnej i traktowanych plazmidem pcDNA 3.1 nie wykryto sygnału białka NLRP3, natomiast kropka sygnału fluorescencyjnego w odpowiedzi na pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine lub pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 wykryto..giardine znajdują się w cytoplazmie lub po stymulacji HEV (ryc. 2e).Dane te ponadto pokazują, że G. duodenalis giardyna alfa-2 i giardyna alfa-7.3 aktywują inflamasom NLRP3 w pierwotnych makrofagach otrzewnowych myszy.
giardyna pcDNA3.1(+)-alfa-2 i giardyna pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 aktywują inflamasom NLRP3 w makrofagach otrzewnej myszy.Transfekować rekombinowane eukariotyczne plazmidy ekspresyjne pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin i pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin do pierwotnych mysich makrofagów i komórek otrzewnowych lub zebrać supernatant w ciągu 24 godzin w celu analizy ekspresji i oligomeryzacji , wydzielina.i lokalizacja kluczowych białek zapalnych.Grupę otrzymującą wyłącznie PBS (C) i grupę pojedynczo leczoną pcDNA3.1(+) zastosowano jako kontrolę ujemną, a grupę leczoną GEV zastosowano jako grupę dodatnią.a Kluczowe białka zapalne NLRP3, w tym NLRP3, pro-IL-1β, prokaspaza-1 i kaspaza p20, wykryto metodą Western blot.b Poziom wydzielania IL-1β w supernatantach określono za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).Różnice między grupą kontrolną i eksperymentalną analizowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 22.0.Gwiazdki wskazują istotne różnice między grupami **P<0,01 i ***P<0,001.c Poziomy oligomeryzacji ASC w peletkach określono za pomocą analizy sieciowania DSS, podczas gdy poziomy ASC w lizatach komórkowych zastosowano jako kontrolę ładowania.d Wizualizacja lokalizacji ISC za pomocą immunofluorescencji.e Immunofluorescencję zastosowano do wizualizacji lokalizacji NLRP3.ASC, apoptotyczne białko plamkowe;IL, interleukina;NLRP3, receptor 3 podobny do oligomeryzacji wiążący nukleotydy;ns, nieistotne (P > 0,05)
Zarówno G. duodenalis, jak i wydzielane przez niego GEV aktywują inflamasom NLRP3 i regulują odpowiedź zapalną gospodarza in vitro.Zatem rola inflamasomu NLRP3 w patogeniczności G. duodenalis pozostaje niejasna.Aby zbadać tę kwestię, zaprojektowaliśmy eksperyment pomiędzy myszami zakażonymi cystą G. duodenalis i myszami zakażonymi cystą G. duodenalis + leczeniem inhibitorem MCC950 i porównaliśmy ekspresję inflamasomu NLRP3 po zakażeniu cystą G. duodenalis.Szczegółowy schemat eksperymentu przedstawiono na rys. 3a.Zmiany masy ciała myszy w różnych grupach leczenia monitorowano przez 7 dni po zakażeniu cystami, a wyniki przedstawiono na ryc. 3b.W porównaniu z grupą leczoną czystym PBS wyniki wykazały, że (i) masa ciała myszy zakażonych cystą G. duodenalis spadła od 3. do 7. dnia po zakażeniu;(ii) leczenie inhibitorem MCC950 nie miało znaczącego wpływu na masę ciała myszy..W porównaniu z grupą z pojedynczą infekcją, masa ciała w grupie z infekcją dwunastnicy leczonej MCC950 spadła w różnym stopniu (dzień 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; dzień 2: ANOVA, F(3, 24 ) = 0,4602, P <0,0001; Dzień 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; Dzień 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; Dzień 6: ANOVA, F(3, 24) = 5,457, P = 0,0175; Dzień 7: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Dane te pokazują, że inflamasom NLRP3 chroni myszy przed znaczną utratą masy ciała we wczesnych stadiach (2-4 dni) infekcji dwunastnicy.Następnie chcieliśmy wykryć trofozoity G. duodenalis w płynie z płukania dwunastnicy, a wyniki przedstawiono na rycinie 3c.W porównaniu z grupą zakażoną cystą G. duodenalis, po zablokowaniu inflamasomu NLRP3, liczba trofozoitów w dwunastnicy znacznie wzrosła (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Tkanki dwunastnicy barwione HE wykazały, w porównaniu z kontrolą ujemną leczoną samym PBS i MCC950: (i) Zakażenie cystą G. duodenalis spowodowało uszkodzenie kosmków dwunastnicy (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488 ) i zanik krypt (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) dwunastnica od myszy zakażonych cystami G. duodenalis i leczonych inhibitorami MCC950.kosmki dwunastnicy były uszkodzone i martwe (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) z zanikiem i rozgałęzieniami krypt (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (ryc. 3d- F) .Wyniki te sugerują, że inflamasom NLRP3 odgrywa rolę w zmniejszaniu patogeniczności G. duodenalis.
Rola inflamasomu NLRP3 w zakażeniu Giardia dwunastnicy.Myszom podano przez sondę (iv) cysty dwunastnicy, a następnie leczono MCC950 lub bez MCC950 (ip).Jako kontrole zastosowano grupy z pojedynczym leczeniem PBS lub MCC950.Grupa eksperymentalna i schemat leczenia.b Masę ciała myszy w każdej z różnych grup leczenia monitorowano przez 7 dni.Różnicę pomiędzy grupą zakażoną G. duodenalis a grupą leczoną infekcją G. duodenalis + MCC950 analizowano za pomocą testu t przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 22.0.Gwiazdki wskazują istotne różnice przy * P <0,05, ** P <0,01 lub *** P <0,001.c Obciążenie pasożytami określono poprzez zliczenie liczby trofozoitów w płynie z płukania dwunastnicy.Różnicę pomiędzy grupą zakażoną G. duodenalis a grupą leczoną infekcją G. duodenalis + MCC950 analizowano za pomocą testu t przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 22.0.Gwiazdki wskazują istotne różnice przy *P <0,05.d Wyniki barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) w histopatologii dwunastnicy.Czerwone strzałki wskazują uszkodzenie kosmków, zielone strzałki wskazują uszkodzenie krypt.Pasek skali: 100 µm.e, f Analiza statystyczna wysokości kosmków dwunastnicy i wysokości krypty myszy.Gwiazdki wskazują istotne różnice przy * P <0,05 i ** P <0,01.Wyniki pochodzą z 7 niezależnych eksperymentów biologicznych.BW, masa ciała;ig, droga podawania dożołądkowego;ip, droga podawania dootrzewnowego;ns, nieistotne (P > 0,05);PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami;WT, typ dziki
Wydzielanie IL-1β jest cechą charakterystyczną aktywacji stanu zapalnego.Aby określić, czy giardina alfa-2 i alfa-7.3 G. duodenalis aktywują inflammasom gospodarza NLRP3 in vivo, użyliśmy nieleczonych myszy WT (grupa pozorowana) i myszy z blokadą inflammasomu NLRP3 (grupa leczenia hamowana MCC950).Szczegółowy schemat eksperymentu przedstawiono na rys. 4a.Grupy eksperymentalne składały się z myszy leczonych PBS, cystą G. duodenalis leczoną przez zgłębnik, domięśniowym wstrzyknięciem pcDNA3.1 i domięśniowym wstrzyknięciem pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardyny lub pcDNA3.1-alfa-7.3 giardyny.W siódmym dniu po domięśniowym podaniu rekombinowanego plazmidu pobrano surowicę i oznaczono poziom IL-1β w każdej grupie.Jak pokazano na Figurze 4b, w grupie MOCK: (i) w porównaniu z grupą PBS, leczenie pcDNA3.1 nie miało istotnego wpływu na wydzielanie IL-1β (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), jednak Wydzielanie IL-β było znacząco podwyższone w grupie cyst G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardine i pcDNA3.1- Domięśniowe wstrzyknięcie giardyny alfa-7,3 znacząco zwiększyło poziom IL-1β w surowicy (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardyna indukowała wysoki poziom wydzielania IL -1β w grupie, której podano domięśniowo giardynę pcDNA3.1-alfa-2 (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .W porównaniu z każdą grupą w grupie leczonej MCC950 i grupie MOCK: (i) Poziomy wydzielania IL-1β w grupie kontrolnej PBS i grupie kontrolnej pcDNA3.1 spadły do pewnego stopnia po zablokowaniu inhibitora MCC950, ale różnica nie była istotne (PBS: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) po zablokowaniu MCC950., wydzielanie IL-1β było znacząco zmniejszone w grupie zakażonej cystą G. duodenalis, grupie giardyny pcDNA3.1-alfa-2 i grupie giardyny pcDNA3.1-alfa-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-alfa-2 giardyna: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardyna: ANOVA, F(9, 58 ) = 3,540, P = 0,0164).Wyniki te sugerują, że giardyna alfa-2 i giardyna alfa-7.3 pośredniczą w aktywacji inflamasomu NLRP3 in vivo.
Giardyny pcDNA3.1(+) aktywują inflamasom gospodarza NLRP3 in vivo.Myszy immunizowano (IM) rekombinowanym eukariotycznym plazmidem ekspresyjnym pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardyna lub pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardyna, a następnie traktowano MCC950 (ip; grupa MCC950) lub nie (grupa obojętna ).Grupę leczoną plazmidem PBS lub pcDNA3.1(+) zastosowano jako kontrolę negatywną, grupę leczoną cystą G. duodenalis zastosowano jako kontrolę pozytywną.Grupa eksperymentalna i schemat leczenia.b Poziomy IL-1β w surowicy myszy mierzono w dniu 7 za pomocą testu ELISA.Różnice między grupami w grupie MOCK analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a różnice między grupą MOCK a grupą MCC950 analizowano za pomocą testu t oprogramowania SPSS w wersji 22.0.Gwiazdki wskazują istotne różnice między grupami leczenia w grupie MOCK, *P<0,05 i ***P<0,001;znaki dolara ($) wskazują istotne różnice między każdą grupą w grupie MOCK i grupą MCC950 przy P <0,05.Wyniki siedmiu niezależnych eksperymentów biologicznych.i, wstrzyknięcie domięśniowe, ns, nieistotne (P > 0,05)
Aby zbadać wpływ aktywacji inflamasomu gospodarza NLRP3 za pośrednictwem giardyny alfa-2 i alfa-7.3 na zakaźność G. duodenalis, użyliśmy myszy WT C57BL/6, którym wstrzyknięto giardynę alfa-2 i giardynę alfa-7.3.plazmid wstrzyknięto domięśniowo po 3 dniach przez zgłębnik żołądkowy torbieli G. duodenalis, po czym myszy obserwowano przez 7 dni.Szczegółowy schemat eksperymentu przedstawiono na rys. 5a.Codziennie mierzono masę ciała każdej myszy, w 7. dniu po podaniu przez sondę żołądkową pobierano próbki świeżej tkanki dwunastnicy, mierzono liczbę trofozoitów i obserwowano zmiany histopatologiczne.Jak pokazano na Figurze 5b, wraz ze wzrostem czasu karmienia, masa ciała myszy w każdej grupie stopniowo wzrastała.MT myszy zaczęła spadać trzeciego dnia po dożołądkowym podaniu cyst G. duodenalis, a następnie stopniowo wzrastała.Aktywacja inflamasomu NLRP3 indukowana przez domięśniowe wstrzyknięcie giardyny alfa-2 i giardyny alfa7.3 znacząco osłabiała utratę masy ciała u myszy (dzień 1: pcDNA3.1-alfa-2 giardyna, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Dzień 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardyna, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Dzień 2: pcDNA3.1-alfa-2 giardyna, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Dzień 2: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardyna, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; Dzień 3: pcDNA3.1-alfa-2 giardyna, ANOVA, F( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dzień 3: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardyna, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083; Dzień 4: pcDNA3.1-alfa-2 giardyna, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Dzień 4: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardyna, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Dzień 5: pcDNA3.1-alfa - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dzień 5: pcDNA3.1-alfa -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dzień 6: pcDNA3 ,1 - giardyna alfa-2, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, dzień 6: giardyna pcDNA3.1-alfa-7.3, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dzień 7: pcDNA3.1-alfa-2 giardyna, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001 Dzień 7: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardyna, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Oceniono obciążenie pasożytnicze w dwunastnicy (ryc. 5c).W porównaniu do nietraktowanej kontroli pozytywnej i grupy, której wstrzyknięto pusty wektor pcDNA3.1, liczba trofozoitów G. duodenalis była znacząco zmniejszona w grupach, którym wstrzyknięto α-2 giardynę i α-7,3 giardynę (pcDNA3.1-alfa -2 giardyna: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7.3 giardyna: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Ponadto giardyna alfa-7.3 działała bardziej ochronnie u myszy niż giardyna alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Wyniki barwienia HE przedstawiono na ryc.5d – f.Myszy, którym wstrzyknięto giardynę alfa-2 i giardynę alfa-7,3, miały mniej uszkodzeń tkanki dwunastnicy, objawiających się uszkodzeniem kosmków, w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto G. duodenalis i myszami, którym wstrzyknięto G. duodenalis w połączeniu z pustym wektorem pcDNA3 .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardyna: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 lub P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardyna: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 lub P = 0,0055) i zmniejszoną atrofię krypt (giardyna pcDNA3.1-alfa-2: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 lub P = 0,0158; giardyna pcDNA3.1-alfa-7.3: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 lub P = 0,0191).Wyniki te sugerują, że giardyna alfa-2 i giardyna alfa-7,3 zmniejszają zakaźność G. duodenalis poprzez aktywację inflamasomu NLRP3 in vivo.
Rola pcDNA3.1(+)-giardyn w zakażeniu G. duodenalis.Myszy immunizowano (IM) rekombinowanymi eukariotycznymi plazmidami ekspresyjnymi pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardyna lub pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardyna, a następnie prowokowano cystami G. duodenalis (ig).Grupę PBS i grupę leczoną pcDNA3.1(+) + torbiel dwunastnicy zastosowano jako grupy kontroli negatywnej, a grupę leczoną cystą dwunastnicy zastosowano jako grupę kontroli pozytywnej.Grupa eksperymentalna i schemat leczenia.b MT myszy w każdej z różnych grup leczenia monitorowano przez 7 dni po prowokacji.Gwiazdki wskazują istotne różnice pomiędzy grupami w grupie G. duodenalis i grupą pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardyny, *P <0,05, **P <0,01 i ***P <0,001;znak dolara ($) wskazuje znaczącą różnicę pomiędzy każdą grupą G. duodenalis a grupą jardine pcDNA3.1(+)-alfa-7.3, $$P<0,01 i $$$P<0,001.c Obciążenie pasożytnicze określono poprzez zliczenie liczby trofozoitów w 1 ml popłuczyn dwunastnicy (długość 3 cm) i wyrażono jako liczbę pasożytów na cm dwunastnicy.Różnice pomiędzy grupą zakażoną G. duodenalis, grupą pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine i grupą pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine analizowano za pomocą jednokierunkowej ANOVA przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 22.0.Gwiazdki wskazują istotne różnice przy ** P <0,01 i *** P <0,001.d Zmiany histopatologiczne w dwunastnicy.Czerwone strzałki wskazują uszkodzenie kosmków, zielone strzałki wskazują uszkodzenie krypt.Pasek skali: 100 µm.e, f Analiza statystyczna wysokości kosmków dwunastnicy myszy (e) i wysokości krypt (f).Różnice między grupami na ryc. 1d analizowano za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 22.0.Gwiazdki wskazują istotne różnice przy * P <0,05 i ** P <0,01.Wyniki siedmiu niezależnych eksperymentów biologicznych.ns, nieistotne (P > 0,05)
Giardia duodenum jest dobrze znanym pasożytem jelitowym ludzi i innych ssaków, który powoduje lambliozę.W 2004 roku została włączona do Inicjatywy WHO na rzecz Chorób Zaniedbanych ze względu na wysoką częstość występowania w ciągu 6 lat, zwłaszcza w społecznościach o niskim statusie społeczno-ekonomicznym [32].Wrodzony układ odpornościowy odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej na infekcję G. duodenalis.Donoszono, że mysie makrofagi pochłaniają i zabijają G. duodenalis poprzez uwalnianie pułapek pozakomórkowych [33].Nasze poprzednie badania wykazały, że G. duodenalis, nieinwazyjny pasożyt zewnątrzkomórkowy, aktywuje szlaki sygnalizacji zapalnej p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 i NLRP3 w mysich makrofagach w celu regulacji odpowiedzi zapalnej gospodarza, a uwolniony GEV może nasilać ten proces.13], 24].Jednakże dokładne PAMP zaangażowane w zapalenie regulowane przez inflamasom NLRP3 w GEV i rola inflammasomu NLRP3 w giardiozie pozostają do wyjaśnienia.Aby rzucić światło na te dwie kwestie, przeprowadziliśmy to badanie.
Inflamasom NLRP3 znajduje się w cytoplazmie komórek odpornościowych i może być aktywowany przez różne cząsteczki, takie jak kryształy kwasu moczowego, toksyny, bakterie, wirusy i pasożyty.W badaniach bakteryjnych zidentyfikowano toksyny jako kluczowe PAMP, które aktywują czujniki stanu zapalnego, prowadząc do stanu zapalnego i śmierci komórek [34].Niektóre toksyny zróżnicowane strukturalnie, takie jak hemolizyna ze Staphylococcus aureus [35] i Escherichia coli [36], hemolizyna BL (HBL) z enterotoksyny (NHE) [37], indukują aktywację zapalenia NLRP3.Badania wirusologiczne wykazały, że białka zjadliwości, takie jak białko otoczki (E) SARS-COV-2 [38] i białko NS5 wirusa Zika [39] są ważnymi PAMP rozpoznawanymi przez receptor NLRP3.W badaniach nad pasożytami donoszono, że wiele pasożytów jest powiązanych z aktywacją inflamasomów żywiciela, np. Toxoplasma gondii, Trichomonas pochwylis [40], Trypanosoma cruzi [41] i Leishmania [42].Białka o gęstych ziarnistościach GRA35, GRA42 i GRA43, związane ze zjadliwością Toxoplasma gondii, są niezbędne do indukcji piroptozy u makrofagów szczurów Lewisa [43].Ponadto niektóre badania Leishmania skupiały się na poszczególnych cząsteczkach zaangażowanych w inflammasom NLRP3, takich jak lipofosfoglikan błony pasożyta [44] lub metaloproteaza cynku [45].Spośród aneksynopodobnej rodziny genów alfa-giardyny, alfa-1 giardyna jest potencjalnym kandydatem na szczepionkę zapewniającą ochronę przed G. duodenalis w modelu mysim [18].W naszym badaniu wybraliśmy czynniki zjadliwości G. duodenalis, giardyny alfa-2 i alfa-7,3, które są unikalne dla giardii, ale stosunkowo rzadziej zgłaszane.Te dwa docelowe geny wklonowano do wektora eukariotycznego układu ekspresyjnego pcDNA3.1(+) w celu analizy aktywacji zapalenia.
W naszym modelu mysim rozszczepione fragmenty kaspazy służą jako markery aktywacji zapalnej.Po stymulacji NLRP3 oddziałuje z ASC, rekrutuje prokaspazy i wytwarza aktywne kaspazy, które rozszczepiają pro-IL-1β i pro-IL-18 na odpowiednio dojrzałe IL-1β i IL-18 -18.Kaspazy zapalne (kaspazy-1, -4, -5 i -11) to konserwatywna rodzina proteaz cysteinowych, które są krytyczne dla wrodzonej obrony i biorą udział w zapaleniu i programowanej śmierci komórki [46].Kaspaza-1 jest aktywowana przez kanoniczne inflamasomy [47], podczas gdy kaspazy-4, -5 i -11 są rozszczepiane podczas tworzenia atypowych inflammasomów [48].W tym badaniu wykorzystaliśmy mysie makrofagi otrzewnowe jako model i zbadaliśmy kaspazę-1 rozszczepioną kaspazą p20-1 jako marker aktywacji zapalenia NLRP3 gospodarza w badaniach infekcji G. duodenalis.Wyniki pokazały, że wiele alfa-giardyn jest odpowiedzialnych za typową aktywację stanu zapalnego, co jest zgodne z odkryciem kluczowych cząsteczek zjadliwości zaangażowanych w bakterie i wirusy.Jednak nasze badanie ma jedynie charakter wstępny i istnieją inne cząsteczki, które mogą aktywować nieklasyczne inflamasomy, ponieważ nasze poprzednie badanie wykazało zarówno klasyczne, jak i nieklasyczne inflamasomy w zakażeniu G. duodenalis [13].Aby dokładniej określić, czy wytworzona kaspaza-1 p20 jest powiązana z inflammasomem NLRP3, transfekowaliśmy giardyny alfa-2 i alfa-7.3 do makrofagów otrzewnowych myszy, aby określić poziomy ekspresji białek kluczowych cząsteczek i poziomy oligomeryzacji ASC, potwierdzając, że obie α-giardyny aktywują inflamasom NLRP3.Nasze wyniki nieznacznie różnią się od wyników Manko-Prykhody i wsp., którzy podali, że stymulacja komórek Caco-2 samymi szczepami G. muris lub E. coli EPEC może zwiększyć intensywność fluorescencji NLRP3, ASC i kaspazy-1, choć nie znacząco, natomiast kostymulacja G. muris i E. coli zwiększyła poziom trzech białek [49].Ta rozbieżność może wynikać z różnic w wyborze gatunków Giardia, linii komórkowych i komórek pierwotnych.Przeprowadziliśmy także testy in vivo z użyciem MCC950 u 5-tygodniowych samic myszy WT C57BL/6, które są bardziej podatne na G. duodenalis.MCC950 to silny i selektywny drobnocząsteczkowy inhibitor NLRP3, który blokuje kanoniczną i niekanoniczną aktywację NLRP3 w stężeniach nanomolowych.MCC950 hamuje aktywację NLRP3, ale nie wpływa na aktywację szlaków zapalnych AIM2, NLRC4 i NLRP1 ani szlaków sygnałowych TLR [27].MCC950 blokuje aktywację NLRP3, ale nie hamuje inicjacji NLRP3, wypływu K+, napływu Ca2+ ani interakcji pomiędzy NLRP3 i ASC;zamiast tego hamuje aktywację inflamasomu NLRP3 poprzez blokowanie oligomeryzacji ASC [27].Dlatego zastosowaliśmy MCC950 w badaniu in vivo w celu określenia roli inflamasomu NLRP3 po wstrzyknięciu giardyny.Aktywowana kaspaza-1 p10 rozszczepia cytokiny prozapalne pro-IL-1β i pro-IL-18 na dojrzałe IL-1β i IL-18 [50].W tym badaniu poziomy IL-1β w surowicy u myszy leczonych giardyną z MCC950 lub bez niego wykorzystano jako wskaźnik aktywacji inflamasomu NLRP3.Zgodnie z oczekiwaniami, leczenie MCC950 znacząco obniżyło poziomy IL-1β w surowicy.Dane te wyraźnie pokazują, że G. duodenalis giardin alfa-2 i giardin alfa-7.3 są zdolne do aktywacji mysiego inflamasomu NLRP3.
Znaczące dane zgromadzone w ciągu ostatniej dekady wykazały, że IL-17A jest głównym regulatorem odporności przeciwko G. muris, indukującym sygnalizację IL-17RA, wytwarzającym peptydy przeciwdrobnoustrojowe i regulującym aktywację dopełniacza [51].Jednakże zakażenie Giardia występuje częściej u młodych dorosłych i donoszono, że zakażenie Giardia u młodych myszy nie aktywuje odpowiedzi IL-17A w celu wywarcia efektu ochronnego [52], co skłoniło badaczy do poszukiwania innych Giardia immunomodulujących.mechanizmy infekcji robakami pasożytniczymi.Autorzy niedawnego badania podali, że G. muris może aktywować inflamasom NLRP3 przez E. coli EPEC, co sprzyja wytwarzaniu peptydów przeciwdrobnoustrojowych i zmniejsza ich zdolność przyłączania oraz liczbę trofozoitów w przewodzie pokarmowym, zmniejszając w ten sposób nasilenie choroby okrężnicy choroby wywoływane przez prątki [49 ].Inflamasom NLRP3 bierze udział w rozwoju różnych chorób.Badania wykazały, że Pseudomonas aeruginosa wyzwala autofagię w makrofagach, aby uniknąć śmierci komórki, a proces ten zależy od aktywacji inflamasomu NLRP3 [53].W przypadku N. caninum reaktywna aktywacja inflamasomu NLRP3 za pośrednictwem reaktywnych form tlenu ogranicza jego replikację u żywiciela, co czyni go potencjalnym celem terapeutycznym [9].Stwierdzono, że Paracoccidioides brasiliensis indukuje aktywację inflamasomu NLRP3 w komórkach dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy, co powoduje uwolnienie cytokiny zapalnej IL-1β, która odgrywa kluczową rolę w obronie gospodarza [10].Kilka gatunków Leishmania, w tym L. amazonensis, L. major, L. braziliensis i L. infantum chagasi, aktywują zależną od NLRP3 i ASC kaspazę-1 w makrofagach, a także infekcję Leishmania.Replikacja pasożyta jest wzmocniona u myszy z niedoborem genu NLRP3/ASC/kaspazy-1 [11].Zamboni i in.Donoszono, że zakażenie Leishmania indukuje aktywację inflamasomu NLRP3 w makrofagach, co ogranicza wewnątrzkomórkową replikację pasożyta.Zatem Leishmania może hamować aktywację NLRP3 w ramach strategii unikania.W badaniach in vivo inflamasom NLRP3 przyczynił się do eliminacji Leishmanii, ale nie miał wpływu na tkanki [54].Odwrotnie, w badaniach robaczycy aktywacja inflamasomu NLRP3 tłumiła ochronną odporność gospodarza przeciwko robaczycy żołądkowo-jelitowej [12].Shigella jest jedną z głównych bakterii powodujących biegunkę na całym świecie.Bakterie te mogą indukować wytwarzanie IL-1β poprzez wypływ K+ za pośrednictwem receptora P2X7, reaktywne formy tlenu, zakwaszenie lizosomów i uszkodzenie mitochondriów.Inflamasom NLRP3 negatywnie reguluje fagocytozę i działanie bakteriobójcze makrofagów przeciwko Shigella [55].Badania Plasmodium wykazały, że myszy z niedoborem AIM2, NLRP3 lub kaspazy-1 zakażone Plasmodium wytwarzają wysoki poziom interferonu typu 1 i są bardziej odporne na zakażenie Plasmodium [56].Jednakże rola giardyny alfa-2 i giardyny alfa-7,3 w wywoływaniu patogennej aktywacji zapalenia NLRP3 u myszy jest niejasna.
W tym badaniu hamowanie inflammasomu NLRP3 przez MCC950 zmniejszyło BW i zwiększyło liczbę trofozoitów w płynie z płukania jelit u myszy, powodując poważniejsze zmiany patologiczne w tkance dwunastnicy.Giardyna alfa-2 i giardina alfa-7.3 aktywują inflammasom NLRP3 myszy gospodarza, zwiększają masę ciała myszy, zmniejszają liczbę trofozoitów w płynie z płukania jelit i łagodzą patologiczne zmiany w dwunastnicy.Wyniki te sugerują, że G. duodenalis może aktywować inflamasom gospodarza NLRP3 poprzez giardynę alfa-2 i giardynę alfa-7,3, zmniejszając patogenność G. duodenalis u myszy.
Łącznie nasze wyniki pokazują, że giardyny alfa-2 i alfa-7,3 indukują aktywację inflamasomu gospodarza NLRP3 i zmniejszają zakaźność G. duodenalis u myszy.Dlatego cząsteczki te są obiecującymi celami w zapobieganiu lambliozie.
Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardioza: przegląd.Niedawno ujawniono, że Pat Inflamm ma alergię na leki.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardioza: przegląd farmakoterapii.Opinia biegłego farmaceuty.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin i Wen Jianfeng.Giardioza, lekooporność i odkrycie nowych celów.Infekuje cele narkotykowe Disord.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T itp. Inflamasom NLRP3 i choroby zapalne.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Rola inflamasomu w zapaleniu jelit i raku.Gastroenterologia.2011;141: 1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanoniczna i atypowa aktywacja inflamasomu NLRP3 na skrzyżowaniu tolerancji immunologicznej i zapalenia jelit.przedimmunologiczny.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S i in.W odpowiedzi na infekcję N. caninum bierze udział aktywacja inflammasomu NLRP3 za pośrednictwem ROS.Wektor pasożyta.2020;13:449.
Czas publikacji: 10 marca 2023 r