Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, będziemy renderować witrynę bez stylów i języka JavaScript.
Toxoplasma gondii to wewnątrzkomórkowy pierwotniak pasożytniczy, który moduluje mikrośrodowisko zakażonego żywiciela i wiadomo, że jest związany z częstością występowania guza mózgu.W tym badaniu postawiliśmy hipotezę, że egzosomalny miRNA-21 z zakażenia Toxoplasma sprzyja wzrostowi guza mózgu.Scharakteryzowano egzosomy z mikrogleju BV2 zakażonego Toxoplasma i potwierdzono internalizację komórek glejaka U87.Profile ekspresji egzosomalnego mikroRNA analizowano przy użyciu macierzy mikroRNA i mikroRNA-21A-5p związanych z Toxoplasma gondii i sortowaniem nowotworów.Zbadaliśmy również poziomy mRNA genów związanych z nowotworem w komórkach glejaka U87, zmieniając poziomy miR-21 w egzosomach i wpływ egzosomów na proliferację ludzkich komórek glejaka U87.W egzosomach komórek glejaka U87 zakażonych Toxoplasma gondii dochodzi do zwiększenia ekspresji mikroRNA-21 i zmniejszenia aktywności genów przeciwnowotworowych (FoxO1, PTEN i PDCD4).Egzosomy pochodzące z BV2 zakażone Toxoplasma indukują proliferację komórek glejaka U87.Egzosomy indukują wzrost komórek U87 w mysim modelu nowotworu.Sugerujemy, że zwiększony egzosomalny miR-21 w mikrogleju BV2 zakażonym Toxoplasma może odgrywać ważną rolę jako promotor wzrostu komórek w komórkach glejaka U87 poprzez obniżenie poziomu genów przeciwnowotworowych.
Szacuje się, że w 2018 roku na całym świecie zdiagnozowano ponad 18,1 miliona przypadków zaawansowanego raka, a każdego roku rozpoznawano około 297 000 guzów ośrodkowego układu nerwowego (1,6% wszystkich nowotworów)1.Wcześniejsze badania wykazały, że czynniki ryzyka rozwoju guzów mózgu u ludzi obejmują różne produkty chemiczne, historię rodzinną oraz promieniowanie jonizujące ze sprzętu terapeutycznego i diagnostycznego głowy.Jednak dokładna przyczyna tych nowotworów nie jest znana.Około 20% wszystkich nowotworów na świecie jest powodowanych przez czynniki zakaźne, w tym wirusy, bakterie i pasożyty3,4.Patogeny zakaźne zakłócają mechanizmy genetyczne komórki gospodarza, takie jak naprawa DNA i cykl komórkowy, i mogą prowadzić do przewlekłego stanu zapalnego i uszkodzenia układu odpornościowego5.
Czynniki zakaźne związane z ludzkim rakiem są najczęstszymi patogenami wirusowymi, w tym wirusami brodawczaka ludzkiego oraz wirusami zapalenia wątroby typu B i C.Pasożyty mogą również odgrywać potencjalną rolę w rozwoju raka u ludzi.Kilka gatunków pasożytów, a mianowicie Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis i Hymenolepis nana, jest zaangażowanych w różne rodzaje raka człowieka 6,7,8.
Toxoplasma gondii jest wewnątrzkomórkowym pierwotniakiem, który reguluje mikrośrodowisko zakażonych komórek gospodarza.Szacuje się, że pasożyt ten zaraża około 30% światowej populacji, narażając całą populację na ryzyko9,10.Toxoplasma gondii może infekować ważne narządy, w tym ośrodkowy układ nerwowy (OUN), i powodować poważne choroby, takie jak śmiertelne zapalenie opon mózgowych i zapalenie mózgu, zwłaszcza u pacjentów z obniżoną odpornością9.Jednak Toxoplasma gondii może również zmieniać środowisko zakażonego żywiciela poprzez modulowanie wzrostu komórek i odpowiedzi immunologicznej u osób z prawidłową odpornością, co prowadzi do utrzymywania się bezobjawowej przewlekłej infekcji9,11.Co ciekawe, biorąc pod uwagę korelację między występowaniem T. gondii a częstością występowania guzów mózgu, niektóre doniesienia sugerują, że zmiany środowiskowe żywiciela in vivo spowodowane przewlekłą infekcją T. gondii przypominają mikrośrodowisko guza.
Egzosomy są znane jako komunikatory międzykomórkowe, które dostarczają zawartość biologiczną, w tym białka i kwasy nukleinowe, z sąsiednich komórek16,17.Egzosomy mogą wpływać na procesy biologiczne związane z nowotworem, takie jak antyapoptoza, angiogeneza i przerzuty w mikrośrodowisku guza.W szczególności miRNA (miRNA), małe niekodujące RNA o długości około 22 nukleotydów, są ważnymi potranskrypcyjnymi regulatorami genów, które kontrolują ponad 30% ludzkiego mRNA poprzez kompleks wyciszający indukowany przez miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii może zakłócać procesy biologiczne poprzez kontrolowanie ekspresji miRNA u zakażonych gospodarzy.MiRNA gospodarza zawierają ważne sygnały regulujące procesy biologiczne gospodarza w celu osiągnięcia strategii przetrwania pasożyta.Zatem badanie zmian w profilu miRNA gospodarza po zakażeniu T. gondii może pomóc nam lepiej zrozumieć interakcję między gospodarzem a T. gondii.Rzeczywiście, Thirugnanam i in.15 zasugerowali, że T. gondii promuje rakotwórczość mózgu poprzez zmianę jego ekspresji na specyficznych miRNA gospodarza związanych ze wzrostem guza i odkryli, że T. gondii może powodować glejaki u zwierząt doświadczalnych.
To badanie koncentruje się na zmianie egzosomalnego miR-21 w mikrogleju gospodarza zakażonym Toxoplasma BV2.Zaobserwowaliśmy możliwą rolę zmienionego egzosomalnego miR-21 we wzroście komórek glejaka U87 z powodu zatrzymania w jądrze FoxO1 / p27, który jest celem nadeksprymowanego miR-21.
Egzosomy pochodzące z BV2 uzyskano za pomocą wirowania różnicowego i zweryfikowano różnymi metodami, aby zapobiec zanieczyszczeniu składnikami komórkowymi lub innymi pęcherzykami.Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE) wykazała różne wzory między białkami wyekstrahowanymi z komórek BV2 i egzosomów (ryc.Znakowanie Alix stwierdzono w białkach egzosomów, ale nie w białkach lizatu komórkowego BV2 (ryc. 1B).Ponadto oczyszczone RNA z egzosomów pochodzących z BV2 analizowano za pomocą bioanalizatora.Podjednostki rybosomalne 18S i 28S były rzadko obserwowane we wzorze migracji egzosomalnego RNA, co wskazuje na wiarygodną czystość (ryc. 1C).Wreszcie transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała, że ​​​​obserwowane egzosomy miały rozmiar około 60–150 nm i miały strukturę przypominającą miseczkę typową dla morfologii egzosomów (ryc. 1D).
Charakterystyka egzosomów pochodzących z komórek BV2.(A) Strona karty charakterystyki.Białka izolowano z komórek BV2 lub egzosomów pochodzących z BV2.Wzory białek różnią się w komórkach i egzosomach.(B) Analiza Western blot markera egzosomalnego (Alix).(C) Ocena oczyszczonego RNA z komórek BV2 i egzosomów pochodzących z BV2 przy użyciu bioanalizatora.Zatem podjednostki rybosomalne 18S i 28S w komórkach BV2 rzadko znajdowano w egzosomalnym RNA.(D) Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała, że ​​egzosomy wyizolowane z komórek BV2 barwiono negatywnie 2% octanem uranylu.Egzosomy mają rozmiar około 60-150 nm i kształt miseczki (Song i Jung, dane niepublikowane).
Za pomocą mikroskopii konfokalnej obserwowano komórkową internalizację egzosomów pochodzących z BV2 do ludzkich komórek glejaka U87.Egzosomy znakowane PKH26 są zlokalizowane w cytoplazmie komórek U87.Jądra barwiono DAPI (ryc. 2A), co wskazuje, że egzosomy pochodzące z BV2 mogą być internalizowane przez komórki gospodarza i wpływać na środowisko komórek biorców.
Internalizacja egzosomów pochodzących z BV2 do komórek glejaka U87 i egzosomów pochodzących z BV2 zakażonych Toxoplasma RH indukowała proliferację komórek glejaka U87.( A ) Egzosomy pochłonięte przez komórki U87 mierzone za pomocą mikroskopii konfokalnej.Komórki glejaka U87 inkubowano z egzosomami wyznakowanymi PKH26 (czerwony) lub bez kontroli przez 24 godziny.Jądra barwiono DAPI (niebieski), a następnie obserwowano pod mikroskopem konfokalnym (pasek skali: 10 μm, x 3000).(B) Proliferację komórek glejaka U87 określono w teście proliferacji komórek.Komórki glejaka U87 traktowano egzosomami przez wskazany czas. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 получено по t-kryteriю Стьюдента. *P < 0,05 według testu t-Studenta. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-kryteryjność Стьюдента. * P < 0,05 uzyskane za pomocą testu t-Studenta.
Po potwierdzeniu internalizacji egzosomów pochodzących z BV2 do komórek glejaka U87, przeprowadziliśmy testy proliferacji komórek w celu zbadania roli egzosomów pochodzących z BV2 pochodzących z Toxoplasma w rozwoju ludzkich komórek glejaka.Traktowanie komórek U87 egzosomami z komórek BV2 zakażonych T. gondii wykazało, że egzosomy pochodzące z BV2 zakażone T. gondii powodowały znacznie wyższą proliferację komórek U87 w porównaniu z kontrolą (ryc. 2B).
Ponadto wzrost komórek U118 miał takie same wyniki jak U87, ponieważ egzosomy stymulowane przez Toxoplasma powodowały najwyższe poziomy proliferacji (dane nie pokazane).Na podstawie tych danych możemy wskazać, że egzosomy zakażone Toxoplasmą pochodzące z BV2 odgrywają ważną rolę w proliferacji komórek glejaka.
Aby zbadać wpływ egzosomów pochodzących z BV2 zakażonych Toxoplasma na rozwój guza, wstrzyknęliśmy komórki glejaka U87 nagim myszom w celu uzyskania modelu heteroprzeszczepu i wstrzyknęliśmy egzosomy pochodzące z BV2 lub egzosomy pochodzące z BV2 zakażone RH.Po tym, jak guzy stały się widoczne po 1 tygodniu, każdą eksperymentalną grupę 5 myszy podzielono według wielkości guza w celu określenia tego samego punktu początkowego, a wielkość guza mierzono przez 22 dni.
U myszy z modelem heteroprzeszczepu U87 zaobserwowano znacznie większy rozmiar i wagę guza w grupie egzosomów zakażonych RH pochodzących z BV2 w dniu 22 (ryc. 3A, B).Z drugiej strony nie było znaczącej różnicy w wielkości guza między grupą egzosomów pochodzących z BV2 a grupą kontrolną po leczeniu egzosomami.Ponadto myszy, którym wstrzyknięto komórki glejaka i egzosomy, wykazywały wizualnie największą objętość guza w grupie egzosomów pochodzących z BV2 zakażonych RH (ryc. 3C).Wyniki te pokazują, że egzosomy zakażone Toxoplasma pochodzące z BV2 indukują wzrost glejaka w mysim modelu nowotworu.
Onkogeneza (AC) egzosomów pochodzących z BV2 w mysim modelu heteroprzeszczepu U87.Rozmiar guza (A) i waga (B) były znacząco zwiększone u nagich myszy BALB/c leczonych egzosomami zakażonymi RH pochodzącymi z BV2.Nagim myszom BALB/c (C) wstrzyknięto podskórnie 1 x 107 komórek U87 zawieszonych w mieszaninie Matrigel.Sześć dni po wstrzyknięciu 100 μg egzosomów pochodzących z BV2 potraktowano myszami.Wielkość i masę guza mierzono odpowiednio we wskazanych dniach i po uśmierceniu. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Dane pokazały, że 37 miRNA (16 z nadekspresją i 21 z obniżoną ekspresją) związanych z odpornością lub rozwojem nowotworu zostało znacząco zmienionych w mikrogleju po zakażeniu szczepem Toxoplasma RH (ryc. 4A).Względne poziomy ekspresji miR-21 wśród zmienionych miRNA zostały potwierdzone przez RT-PCR w czasie rzeczywistym w egzosomach pochodzących z BV2, egzosomach traktowanych komórkami BV2 i U87.Ekspresja miR-21 wykazała znaczny wzrost egzosomów z komórek BV2 zakażonych Toxoplasma gondii (szczep RH) (ryc. 4B).Względne poziomy ekspresji miR-21 w komórkach BV2 i U87 wzrosły po pobraniu zmienionych egzosomów (ryc. 4B).Względne poziomy ekspresji miR-21 w tkankach mózgowych pacjentów z nowotworem i myszy zakażonych Toxoplasma gondii (szczep ME49) były odpowiednio wyższe niż u kontroli (ryc. 4C).Wyniki te korelują z różnicami między poziomami ekspresji przewidywanych i potwierdzonych mikroRNA in vitro i in vivo.
Zmiany w ekspresji egzosomalnego miP-21a-5p w mikrogleju zakażonym Toxoplasma gondii (RH).(A) Wykazuje znaczące zmiany w siRNA związane z odpornością lub rozwojem nowotworu po zakażeniu T. gondii RH.(B) Względne poziomy ekspresji miR-21 wykryto za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym w egzosomach pochodzących z BV2, egzosomach traktowanych BV2 i komórkach U87.(C) Względne poziomy ekspresji miR-21 stwierdzono w tkankach mózgowych pacjentów z nowotworem (N=3) i myszy zakażonych Toxoplasma gondii (szczep ME49) (N=3). *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-kryteryjność Стьюдента. * P < 0,05 uzyskane za pomocą testu t-Studenta.
Egzosomy z komórek BV2 zakażonych RH doprowadziły do ​​​​wzrostu glejaków in vivo i in vitro (ryc. 2, 3).Aby wykryć odpowiednie mRNA, zbadaliśmy poziomy mRNA docelowych genów przeciwnowotworowych, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN i zaprogramowaną śmierć komórki 4 (PDCD4) w komórkach U87 zakażonych egzosomami pochodzącymi z BV2 lub RH BV2.Analiza bioinformatyczna wykazała, że ​​kilka genów związanych z nowotworami, w tym geny FoxO1, PTEN i PDCD4, ma miejsca wiązania miR-2121,22.Poziomy mRNA docelowych genów przeciwnowotworowych były zmniejszone w egzosomach pochodzących z BV2 zakażonych RH w porównaniu z egzosomami pochodzącymi z BV2 (ryc. 5A).FoxO1 wykazał obniżone poziomy białka w egzosomach pochodzących z BV2 zakażonych RH w porównaniu z egzosomami pochodzącymi z BV2 (Figura 5B).Na podstawie tych wyników mogliśmy potwierdzić, że egzosomy pochodzące z BV2 zakażonego RH obniżają poziom genów antyonkogennych, utrzymując ich rolę we wzroście guza.
Egzosomy pochodzące z BV2 zakażone Toxoplasma RH indukują supresję genów przeciwnowotworowych w komórkach glejaka U87 przez egzosomy pochodzące z BV2 zakażone Toxoplasma RH.( A ) PCR w czasie rzeczywistym ekspresji FoxO1, PTEN i PDCD4 w egzosomach pochodzących z BV2 zakażonego RH T. gondii w porównaniu z egzosomami PBS.Jako kontrolę zastosowano mRNA β-aktyny.(B) Ekspresję FoxO1 określono metodą Western blotting, a dane densytometryczne oceniono statystycznie przy użyciu programu ImageJ. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 uzyskano za pomocą testu t-Studenta. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-kryteryjność Стьюдента. * P < 0,05 uzyskane za pomocą testu t-Studenta.
Aby zrozumieć wpływ miP-21 w egzosomach na regulację genów związanych z nowotworem, komórki U87 transfekowano inhibitorem miP-21 przy użyciu Lipofectamine 2000 i komórki zebrano 24 godziny po transfekcji.Poziomy ekspresji FoxO1 i p27 w komórkach transfekowanych inhibitorami miR-21 porównano z komórkami traktowanymi egzosomami pochodzącymi z BV2 przy użyciu qRT-PCR (ryc. 6A, B).Transfekcja inhibitora miR-21 do komórek U87 znacząco obniżyła ekspresję FoxO1 i p27 (fig. 6).
Zakażony RH egzosomalny miP-21 pochodzący z BV2 zmienił ekspresję FoxO1 / p27 w komórkach glejaka U87.Komórki U87 transfekowano inhibitorem miP-21 przy użyciu Lipofectamine 2000 i komórki zebrano 24 godziny po transfekcji.Poziomy ekspresji FoxO1 i p27 w komórkach transfekowanych inhibitorami miR-21 porównano z poziomami w komórkach traktowanych egzosomami pochodzącymi z BV2 przy użyciu qRT-PCR (A, B).
Aby uciec przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza, pasożyt Toxoplasma przekształca się w cystę tkankową.Pasożytują różne tkanki, w tym mózg, serce i mięśnie szkieletowe, przez całe życie gospodarza i modulują odpowiedź immunologiczną gospodarza.Ponadto mogą regulować cykl komórkowy i apoptozę komórek gospodarza, promując ich proliferację14,24.Toxoplasma gondii zakaża głównie komórki dendrytyczne gospodarza, neutrofile i linię monocytów/makrofagów, w tym mikroglej mózgu.Toxoplasma gondii indukuje różnicowanie makrofagów o fenotypie M2, wpływa na gojenie się ran po zakażeniu patogenem, a także jest związana z hiperunaczynieniem i zwłóknieniem ziarniniakowym.Ta behawioralna patogeneza zakażenia Toxoplasma może być związana z markerami związanymi z rozwojem nowotworu.Wrogie środowisko regulowane przez Toxoplasma może przypominać odpowiedni stan przedrakowy.Można zatem przypuszczać, że infekcja Toxoplasma powinna przyczyniać się do rozwoju guzów mózgu.W rzeczywistości odnotowano wysokie wskaźniki zakażenia Toxoplasma w surowicy pacjentów z różnymi guzami mózgu.Ponadto Toxoplasma gondii może być kolejnym efektorem rakotwórczym i działać synergistycznie, pomagając innym zakaźnym czynnikom rakotwórczym w rozwoju guzów mózgu.W tym względzie warto zauważyć, że P. falciparum i wirus Epstein-Barr synergistycznie przyczyniają się do powstania chłoniaka Burkitta.
Rola egzosomów jako regulatorów w dziedzinie badań nad rakiem została szeroko zbadana.Jednak rola egzosomów między pasożytami a zakażonymi żywicielami pozostaje słabo poznana.Jak dotąd różne regulatory, w tym wydzielane białka, wyjaśniły procesy biologiczne, dzięki którym pierwotniaki pasożytnicze opierają się atakowi żywiciela i utrwalają infekcję.Ostatnio pojawiła się koncepcja, że ​​mikropęcherzyki związane z pierwotniakami i ich mikroRNA oddziałują z komórkami gospodarza, tworząc sprzyjające środowisko dla ich przeżycia.Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby odkryć związek między zmienionymi egzosomalnymi miRNA a proliferacją komórek glejaka.Zmiana mikroRNA (geny klastrowe miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 i miR-17-92) wiąże się z promotorem STAT3 w ludzkich makrofagach zakażonych toksoplazmą, jest regulowana i indukuje anty -apoptoza w odpowiedzi na infekcję Toxoplasma gondii 29 .Infekcja Toxoplasma zwiększa ekspresję miR-17-5p i miR-106b-5p, które są związane z kilkoma chorobami hiperproliferacyjnymi 30 .Dane te sugerują, że miRNA gospodarza regulowane przez infekcję Toxoplasma są ważnymi cząsteczkami dla przeżycia pasożyta i patogenezy zachowania biologicznego gospodarza.
Zmienione miRNA mogą wpływać na różne typy zachowań podczas inicjacji i progresji komórek złośliwych, w tym glejaków: samowystarczalność sygnałów wzrostu, niewrażliwość na sygnały hamujące wzrost, unikanie apoptozy, nieograniczony potencjał replikacyjny, angiogenezę, inwazję i przerzuty oraz zapalenie.W glejakach zmienione miRNA zidentyfikowano w kilku badaniach profilowania ekspresji.
W niniejszym badaniu potwierdziliśmy wysoki poziom ekspresji miRNA-21 w komórkach gospodarza zakażonych toksoplazmą.miR-21 został zidentyfikowany jako jeden z najczęściej nadeksprymowanych mikroRNA w guzach litych, w tym w glejakach, 33 a jego ekspresja koreluje ze stopniem zaawansowania glejaka.Coraz więcej dowodów sugeruje, że miR-21 jest nowym onkogenem, który działa jako czynnik antyapoptotyczny we wzroście glejaka i jest wysoce nadeksprymowany w tkankach i osoczu nowotworów złośliwych ludzkiego mózgu.Co ciekawe, inaktywacja miR-21 w komórkach i tkankach glejaka wyzwala hamowanie proliferacji komórek z powodu apoptozy zależnej od kaspazy.Analiza bioinformatyczna przewidywanych celów miR-21 ujawniła wiele genów supresorowych nowotworów związanych ze szlakami apoptozy, w tym zaprogramowaną śmiercią komórki 4 (PDCD4), tropomiozyną (TPM1), PTEN i forkhead box O1 (FoxO1), z miejscem wiązania miR-2121..22.38.
FoxO1, jako jeden z czynników transkrypcyjnych (FoxO), bierze udział w rozwoju różnych typów nowotworów u ludzi i może regulować ekspresję genów supresorowych, takich jak p21, p27, Bim i FasL40.FoxO1 może wiązać i aktywować inhibitory cyklu komórkowego, takie jak p27, w celu zahamowania wzrostu komórek.Ponadto FoxO1 jest kluczowym efektorem sygnalizacji PI3K/Akt i reguluje wiele procesów biologicznych, takich jak progresja cyklu komórkowego i różnicowanie komórek poprzez aktywację transkrypcji p2742.
Podsumowując, uważamy, że egzosomalny miR-21 pochodzący z mikrogleju zakażonego Toxoplasma może odgrywać ważną rolę jako regulator wzrostu komórek glejaka (ryc. 7).Jednak potrzebne są dalsze badania, aby znaleźć bezpośredni związek między egzosomalnym miR-21, zmienioną infekcją Toxoplasma i wzrostem glejaka.Oczekuje się, że wyniki te stanowić będą punkt wyjścia do badania związku między zakażeniem Toxoplasma a częstością występowania glejaka.
W tym badaniu zaproponowano schematyczny diagram mechanizmu karcynogenezy glejaka (mózgu).Autor rysuje w programie PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Wszystkie protokoły eksperymentalne w tym badaniu, w tym wykorzystywanie zwierząt, były zgodne ze standardowymi wytycznymi etycznymi Seoul National University Animal Care and User Committee i zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of Seoul National University School of Medicine (numer IRB SNU- 150715).-2).Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z zaleceniami ARRIVE.
Komórki mysiego mikrogleju BV2 i ludzkiego glejaka U87 hodowano odpowiednio w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seul, Korea) i Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), z których każda zawierała 10% płodowej surowicy bydlęcej, 4 mM l- glutamina, 0,2 mM penicylina i 0,05 mM streptomycyna.Komórki hodowano w inkubatorze z 5% CO2 w 37°C.Do porównania z komórkami U87 zastosowano inną linię komórkową glejaka, U118.
Aby wyizolować egzosomy ze szczepów RH i ME49 zakażonych T. gondii, zebrano tachyzoity T. gondii (szczep RH) z jamy brzusznej 6-tygodniowych myszy BALB/c, którym wstrzyknięto 3-4 dni wcześniej.Tachyzoity przemyto trzykrotnie PBS i oczyszczono przez wirowanie w 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.W celu uzyskania tachyzoitów szczepu ME49, myszom BALB/c wstrzyknięto dootrzewnowo 20 cyst tkankowych i zebrano transformację tachyzoitów w cystach przez płukanie jamy brzusznej w 6-8 dniu po zakażeniu (PI).Myszy zakażone PBS.Tachyzoity ME49 hodowano w komórkach uzupełnionych 100 μg/ml penicyliny (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomycyny (Gibco/BRL) i 5% płodowej surowicy bydlęcej (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla.Po hodowli w komórkach Vero, tachyzoity ME49 przepuszczono dwukrotnie przez igłę o rozmiarze 25, a następnie przez filtr 5 µm w celu usunięcia szczątków i komórek.Po przemyciu tachyzoity ponownie zawieszono w PBS44.Torbiele tkankowe szczepu ME49 Toxoplasma gondii utrzymywano przez wstrzyknięcie dootrzewnowe cyst wyizolowanych z mózgu zakażonych myszy C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Mózgi myszy zakażonych ME49 zebrano po 3 miesiącach PI i zmielono pod mikroskopem w celu wyizolowania cyst.Zakażone myszy trzymano w specjalnych warunkach wolnych od patogenów (SPF) w Seoul National University School of Medicine.
Całkowity RNA ekstrahowano z egzosomów pochodzących z BV2, komórek i tkanek BV2 przy użyciu zestawu miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta, w tym czasem inkubacji dla etapu elucji.Stężenie RNA oznaczano na spektrofotometrze NanoDrop 2000.Jakość mikromacierzy RNA oceniano za pomocą bioanalizatora Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Holandia).
DMEM z 10% FBS ubogim w egzosom przygotowano przez ultrawirowanie przy 100 000 g przez 16 godzin w 4°C i przesączono przez filtr 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).Komórki BV2, 5 x 105, hodowano w DMEM zawierającym 10% FBS zubożony w egzosom i 1% antybiotyków w 37°C i 5% CO2.Po 24 godzinach inkubacji do komórek dodano tachyzoity szczepu RH lub ME49 (MOI = 10) i nieinwazyjne pasożyty usunięto w ciągu godziny i uzupełniono DMEM.Egzosomy z komórek BV2 wyizolowano przez zmodyfikowane wirowanie różnicowe, najczęściej stosowaną metodę.Ponownie zawiesić osad egzosomu w 300 µl PBS do analizy RNA lub białka.Stężenie wyizolowanych egzosomów określono za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) i spektrofotometru NanoDrop 2000.
Precypitaty z komórek BV2 lub egzosomów pochodzących z BV2 poddano lizie w roztworze do ekstrakcji białek PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) i białka naniesiono na żele poliakryloamidowe barwione błękitem brylantowym Coomassie 10% SDS.Ponadto białka przenoszono na membrany PVDF na 2 godziny.Western blot walidowano przy użyciu przeciwciała Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) jako markera egzosomalnego.Jako drugorzędowe przeciwciało zastosowano kozią anty-mysią IgG skoniugowaną z HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) i analizator obrazu luminescencyjnego LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokio, Japonia)..Przeprowadzono transmisyjną mikroskopię elektronową w celu zbadania wielkości i morfologii egzosomów.Egzosomy wyizolowane z komórek BV2 (6,40 µg/µl) przygotowano na siatkach powleczonych węglem i barwiono negatywnie 2% octanem uranylu przez 1 min.Przygotowane próbki obserwowano przy napięciu przyspieszającym 80 kV za pomocą JEOL 1200-EX II (Tokio, Japonia) wyposażonego w kamerę ES1000W Erlangshen CCD (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Egzosomy pochodzące z BV2 barwiono przy użyciu zestawu PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Komórki U87, 2 x 105, z egzosomami znakowanymi PKH26 (czerwony) lub bez egzosomów jako kontrola negatywna, inkubowano w 37°C przez 24 godziny w inkubatorze z 5% CO2.Jądra komórkowe U87 barwiono DAPI (niebieski), komórki U87 utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez 15 minut w 4°C, a następnie analizowano w systemie mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Niemcy).zauważalny.
cDNA zsyntetyzowano z siRNA przy użyciu syntezy pierwszej nici Mir-X siRNA i zestawu SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japonia).Przeprowadzono ilościową PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu wykrywania PCR w czasie rzeczywistym iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) przy użyciu starterów i matryc zmieszanych z SYBR Premix.DNA amplifikowano przez 40 cykli denaturacji w 95°C przez 15 si hybrydyzacji w 60°C przez 60 s.Dane z każdej reakcji PCR analizowano przy użyciu modułu analizy danych oprogramowania systemu optycznego iQ™5 (Bio-Rad).Względne zmiany w ekspresji genów między wybranymi genami docelowymi a β-aktyną/siRNA (i U6) obliczono stosując metodę krzywej standardowej.Stosowane sekwencje starterów przedstawiono w Tabeli 1.
3 x 104 komórek glejaka U87 wysiano na 96-studzienkowych płytkach i zmieszano z egzosomami zakażonymi Toxoplasma pochodzącymi z BV2 (50 μg/ml) lub egzosomami niepulsującymi pochodzącymi z BV2 (50 μg/ml) jako kontrolami po 12, 18 i 36 godzinach .Szybkość proliferacji komórek określono przy użyciu zestawu Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonia) (rysunki uzupełniające S1-S3) 46 .
5-tygodniowe samice nagich myszy BALB / c zakupiono od Orient Bio (Seongnam-si, Korea Południowa) i trzymano pojedynczo w sterylnych klatkach w temperaturze pokojowej (22 ± 2 ° C) i wilgotności (45 ± 15 ° C).%) w temperaturze pokojowej (22±2°C) i wilgotności (45±15%).12-godzinny cykl światła i 12-godzinny cykl ciemności przeprowadzono w ramach SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Myszy losowo podzielono na trzy grupy po 5 myszy każda i wszystkim grupom wstrzyknięto podskórnie 400 ml PBS zawierającego 1 x 107 komórek glejaka U87 i BD Matrigel™ o obniżonej zawartości czynnika wzrostu (BD Science, Miami, FL, USA).Sześć dni po wstrzyknięciu nowotworu, 200 mg egzosomów pochodzących z komórek BV2 (z/bez zakażenia Toxoplasma) wstrzyknięto w miejsce nowotworu.Dwadzieścia dwa dni po zakażeniu nowotworem wielkość guza myszy w każdej grupie mierzono suwmiarką trzy razy w tygodniu, a objętość guza obliczano według wzoru: 0,5 x (szerokość) x 2 x długość.
Analiza ekspresji mikroRNA przy użyciu macierzy miRNA miRCURYTM LNA, macierze 7 generacji has, mmu i rno (EXIQON, Vedbaek, Dania) obejmujące 1119 dobrze scharakteryzowanych myszy spośród 3100 ludzkich, mysich i szczurzych sond wychwytujących miRNA.Podczas tej procedury z 5'-fosforanu usunięto 250 do 1000 ng całkowitego RNA przez traktowanie cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną, a następnie znakowanie zielonym barwnikiem fluorescencyjnym Hy3.Wyznakowane próbki następnie hybrydyzowano przez załadowanie szkiełek mikromacierzy przy użyciu zestawu komory do hybrydyzacji (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) i zestawu szkiełek do hybrydyzacji (Agilent Technologies).Hybrydyzację prowadzono przez 16 godzin w temperaturze 56°C, następnie mikromacierze przemywano zgodnie z zaleceniami producenta.Przetworzone szkiełka mikromacierzy skanowano następnie przy użyciu systemu skanera mikromacierzy Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Zeskanowane obrazy importowano przy użyciu oprogramowania Agilent Feature Extraction w wersji 10.7.3.1 (Agilent Technologies), a intensywność fluorescencji każdego obrazu określono ilościowo przy użyciu odpowiedniego pliku GAL zmodyfikowanego protokołu Exiqon.Dane z mikromacierzy dla bieżącego badania są zdeponowane w bazie danych GEO pod numerem dostępu GPL32397.
Profile ekspresji dojrzałych egzosomalnych miRNA w mikrogleju szczepów RH lub ME49 zakażonych Toxoplasma analizowano przy użyciu różnych narzędzi sieciowych.miRNA związane z rozwojem nowotworu zidentyfikowano za pomocą miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) i odfiltrowano ze znormalizowaną intensywnością sygnału (log2) większą niż 8,0.Wśród miRNA stwierdzono, że miRNA o różnej ekspresji były ponad 1,5-krotnie zmienione przez analizę filtrową miRNA zmienionych przez szczepy RH lub ME49 zakażone T. gondii.
Komórki wysiano na płytkach sześciostudzienkowych (3 x 105 komórek/studzienkę) w opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Transfekowane komórki hodowano przez 6 godzin, a następnie pożywkę zmieniono na świeżą pełną pożywkę.Komórki zebrano 24 godziny po transfekcji.
Analizę statystyczną przeprowadzono głównie za pomocą testu t-Studenta z oprogramowaniem Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Do eksperymentalnej analizy zwierząt przeprowadzono dwukierunkową ANOVA przy użyciu oprogramowania Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Wartości p < 0,05 uznano za istotne statystycznie. Wartości P < 0,05 uznano za istotne statystycznie. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Wartości P <0,05 uznano za istotne statystycznie. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义. P<0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Wartości P <0,05 uznano za istotne statystycznie.
Wszystkie protokoły eksperymentalne zastosowane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of Seoul National University School of Medicine (numer IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. i in.Szacunkowa globalna zachorowalność i umieralność na nowotwory złośliwe w 2018 r.: źródła i metody GLOBOCAN.Interpretacja.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS Wgląd w czynniki ryzyka guzów mózgu i ich interwencje terapeutyczne. Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS Wgląd w czynniki ryzyka guzów mózgu i ich interwencje terapeutyczne.Rashid, S., Rehman, K. i Akash, MS Przegląd czynników ryzyka dla guzów mózgu i głównych interwencji terapeutycznych. Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS. Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS Głębokie zrozumienie czynników ryzyka guza mózgu i interwencji terapeutycznych.Rashid, S., Rehman, K. i Akash, MS Przegląd czynników ryzyka dla guzów mózgu i głównych interwencji terapeutycznych.Nauka biomedyczna.Farmaceuta.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interakcje bakteryjne-wirusowe w raku przewodu pokarmowego i żeńskich narządów płciowych u ludzi: podsumowanie dowodów epidemiologicznych i laboratoryjnych. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interakcje bakteryjne-wirusowe w raku przewodu pokarmowego i żeńskich narządów płciowych u ludzi: podsumowanie dowodów epidemiologicznych i laboratoryjnych.Kato I., Zhang J. i Sun J. Interakcje bakteryjne-wirusowe w raku ludzkiego przewodu pokarmowego i żeńskich narządów płciowych: podsumowanie danych epidemiologicznych i laboratoryjnych. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interakcje bakterio-wirusowe w trawieniu w jamie ustnej człowieka i żeńskim układzie rozrodczym: podsumowanie popularnej nauki o chorobach i dowodów laboratoryjnych.Kato I., Zhang J. i Sun J. Interakcje bakterio-wirusowe w ludzkim raku przewodu pokarmowego i żeńskim raku narządów płciowych: podsumowanie danych epidemiologicznych i laboratoryjnych.Rak 14, 425 (2022).
Magon, KL i Parish, JL Od infekcji do raka: jak wirusy nowotworowe DNA zmieniają centralny metabolizm węgla i lipidów w komórce gospodarza. Magon, KL i Parish, JL Od infekcji do raka: jak wirusy nowotworowe DNA zmieniają centralny metabolizm węgla i lipidów w komórce gospodarza.Mahon, KL i Parish, JL Zakażenie ogniem na raka: jak wirusy nowotworowe oparte na DNA zmieniają centralny metabolizm węgla i lipidów w komórce gospodarza. Magon, KL & Parish, JL Magon, KL i Parish, JL Od infekcji do raka: jak wirusy nowotworowe DNA zmieniają centralny metabolizm węgla i lipidów w komórce gospodarza.Mahon, KL i Parish, JL Fires infekcja raka: jak wirusy nowotworowe DNA zmieniają centralny metabolizm węgla i lipidów w komórkach gospodarza.Biologia otwarta.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM i in.Estrogeny katecholowe schistosomów i przywry wątrobowej oraz raka związanego z robakami.przód.gorąco w środku.5, 444 (2014).