Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy użycie zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłość wsparcia, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Wektory genowe do leczenia mukowiscydozy płuc muszą być kierowane do przewodzących dróg oddechowych, ponieważ obwodowa transdukcja płuc nie ma efektu terapeutycznego.Skuteczność transdukcji wirusa jest bezpośrednio związana z czasem przebywania nośnika.Jednakże płyny dostarczające, takie jak nośniki genów, naturalnie dyfundują do pęcherzyków płucnych podczas inhalacji, a cząstki terapeutyczne o dowolnym kształcie są szybko usuwane poprzez transport śluzowo-rzęskowy.Wydłużenie czasu przebywania nośników genów w drogach oddechowych jest ważne, ale trudne do osiągnięcia.Cząsteczki magnetyczne sprzężone z nośnikiem, które można skierować na powierzchnię dróg oddechowych, mogą usprawnić kierowanie regionalne.Ze względu na problemy z obrazowaniem in vivo zachowanie takich małych cząstek magnetycznych na powierzchni dróg oddechowych w obecności przyłożonego pola magnetycznego jest słabo poznane.Celem tego badania było wykorzystanie obrazowania synchrotronowego do wizualizacji in vivo ruchu szeregu cząstek magnetycznych w tchawicy znieczulonych szczurów w celu zbadania dynamiki i wzorców zachowania pojedynczych i masowych cząstek in vivo.Następnie oceniliśmy również, czy dostarczanie lentiwirusowych cząstek magnetycznych w obecności pola magnetycznego zwiększy skuteczność transdukcji w tchawicy szczura.Synchrotronowe obrazowanie rentgenowskie pokazuje zachowanie cząstek magnetycznych w stacjonarnych i ruchomych polach magnetycznych in vitro i in vivo.Cząsteczek nie można łatwo przeciągnąć po powierzchni żywych dróg oddechowych za pomocą magnesów, jednak podczas transportu osady gromadzą się w polu widzenia, gdzie pole magnetyczne jest najsilniejsze.Wydajność transdukcji wzrosła również sześciokrotnie, gdy lentiwirusowe cząstki magnetyczne były dostarczane w obecności pola magnetycznego.Podsumowując, wyniki te sugerują, że lentiwirusowe cząstki magnetyczne i pola magnetyczne mogą stanowić cenne podejście do poprawy ukierunkowania wektorów genowych i poziomów transdukcji w przewodzących drogach oddechowych in vivo.
Mukowiscydoza (CF) jest spowodowana zmianami w pojedynczym genie zwanym transbłonowym regulatorem przewodnictwa CF (CFTR).Białko CFTR jest kanałem jonowym obecnym w wielu komórkach nabłonkowych w całym organizmie, w tym w drogach oddechowych, które są głównym miejscem patogenezy mukowiscydozy.Wady CFTR prowadzą do nieprawidłowego transportu wody, odwodnienia powierzchni dróg oddechowych i zmniejszenia głębokości warstwy płynu powierzchniowego dróg oddechowych (ASL).Upośledza także zdolność układu transportu śluzowo-rzęskowego (MCT) do oczyszczania dróg oddechowych z wdychanych cząstek i patogenów.Naszym celem jest opracowanie terapii genowej lentiwirusowej (LV) w celu dostarczenia prawidłowej kopii genu CFTR i poprawy ASL, MCT i zdrowia płuc, a także dalszy rozwój nowych technologii umożliwiających pomiar tych parametrów in vivo1.
Wektory LV są jednymi z wiodących kandydatów do terapii genowej mukowiscydozy, głównie dlatego, że mogą trwale integrować gen terapeutyczny z komórkami podstawnymi dróg oddechowych (komórkami macierzystymi dróg oddechowych).Jest to ważne, ponieważ mogą przywrócić normalne nawodnienie i usuwanie śluzu poprzez różnicowanie się w funkcjonalne komórki powierzchni dróg oddechowych z skorygowanymi genami, związane z mukowiscydozą, co przynosi korzyści przez całe życie.Wektory LV muszą być skierowane w stronę przewodzących dróg oddechowych, ponieważ w tym miejscu rozpoczyna się zajęcie płuc w CF.Dostarczenie wektora głębiej do płuc może spowodować transdukcję pęcherzykową, ale nie ma to efektu terapeutycznego w przypadku mukowiscydozy.Jednakże płyny, takie jak nośniki genów, w sposób naturalny migrują do pęcherzyków płucnych podczas wdychania po porodzie3,4, a cząstki terapeutyczne są szybko wydalane do jamy ustnej przez MCT.Skuteczność transdukcji LV jest bezpośrednio związana z czasem, przez jaki wektor pozostaje blisko komórek docelowych, aby umożliwić wychwyt komórkowy – „czas przebywania” 5, który można łatwo skrócić poprzez typowy regionalny przepływ powietrza, jak również skoordynowany wychwyt śluzu i cząstek MCT.W przypadku mukowiscydozy zdolność do wydłużenia czasu przebywania LV w drogach oddechowych jest ważna dla osiągnięcia wysokiego poziomu transdukcji w tym obszarze, ale jak dotąd stanowiła wyzwanie.
Aby pokonać tę przeszkodę, proponujemy, aby cząstki magnetyczne niskiego napięcia (MP) mogły pomóc na dwa uzupełniające się sposoby.Po pierwsze, można je kierować za pomocą magnesu na powierzchnię dróg oddechowych, aby poprawić celowanie i pomóc cząsteczkom nośnika genu znaleźć się we właściwym obszarze dróg oddechowych;i ASL) przemieszczają się do warstwy komórkowej 6. MP są szeroko stosowane jako ukierunkowane nośniki leków, gdy wiążą się z przeciwciałami, lekami stosowanymi w chemioterapii lub innymi małymi cząsteczkami, które przyłączają się do błon komórkowych lub wiążą się z odpowiednimi receptorami na powierzchni komórek i gromadzą się w miejscach guza obecność elektryczności statycznej.Pola magnetyczne w terapii nowotworów 7. Inne metody „hipertermiczne” mają na celu zabijanie komórek nowotworowych poprzez ogrzewanie MP pod wpływem oscylującego pola magnetycznego.Zasada transfekcji magnetycznej, w której pole magnetyczne wykorzystuje się jako środek do transfekcji w celu zwiększenia transferu DNA do komórek, jest powszechnie stosowana in vitro przy użyciu szeregu niewirusowych i wirusowych wektorów genów w przypadku linii komórkowych trudnych do transdukcji ..Ustalono skuteczność magnetotransfekcji LV poprzez dostarczenie LV MP in vitro do linii komórkowej ludzkiego nabłonka oskrzeli w obecności statycznego pola magnetycznego, zwiększając skuteczność transdukcji 186 razy w porównaniu z samym wektorem LV.LV MT zastosowano także w modelu in vitro mukowiscydozy, gdzie transfekcja magnetyczna zwiększyła transdukcję LV w hodowlach na granicy faz powietrze-ciecz 20-krotnie w obecności plwociny mukowiscydozy10.Jednakże magnetotransfekcji narządów in vivo poświęcono stosunkowo niewiele uwagi i oceniano ją jedynie w kilku badaniach na zwierzętach11,12,13,14,15, szczególnie w płucach16,17.Jednakże możliwości transfekcji magnetycznej w terapii płuc w mukowiscydozie są jasne.Tan i in.(2020) stwierdzili, że „badanie walidacyjne dotyczące skutecznego dostarczania nanocząstek magnetycznych do płuc utoruje drogę przyszłym strategiom inhalacji CFTR w celu poprawy wyników klinicznych u pacjentów z mukowiscydozą”6.
Zachowanie małych cząstek magnetycznych na powierzchni dróg oddechowych w obecności przyłożonego pola magnetycznego jest trudne do wizualizacji i badania, w związku z czym są słabo poznane.W ramach innych badań opracowaliśmy metodę obrazowania rentgenowskiego z kontrastem fazowym w oparciu o propagację synchrotronu (PB-PCXI) do nieinwazyjnego obrazowania i ilościowego oznaczania drobnych zmian in vivo w głębokości ASL18 i zachowaniu MCT1920 w celu bezpośredniego pomiaru uwodnienia powierzchni kanału gazowego i jest stosowany jako wczesny wskaźnik skuteczności leczenia.Ponadto w naszej metodzie punktacji MCT wykorzystuje się cząstki o średnicy 10–35 µm składające się z tlenku glinu lub szkła o wysokim współczynniku załamania światła jako markery MCT widoczne za pomocą PB-PCXI21.Obie metody nadają się do obrazowania szeregu typów cząstek, w tym MP.
Ze względu na wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową nasze testy ASL i MCT oparte na PB-PCXI dobrze nadają się do badania dynamiki i wzorców zachowań pojedynczych i masowych cząstek in vivo, aby pomóc nam zrozumieć i zoptymalizować metody dostarczania genów MP.Podejście, które tu stosujemy, opiera się na naszych badaniach z wykorzystaniem linii wiązki SPring-8 BL20B2, w których wizualizowaliśmy ruch płynu po podaniu dawki fikcyjnego wektora do nosowych i płucnych dróg oddechowych myszy, aby pomóc wyjaśnić obserwowane przez nas heterogeniczne wzorce ekspresji genów w naszym genie.badania na zwierzętach z dawką nośnikową 3,4.
Celem tego badania było wykorzystanie synchrotronu PB-PCXI do wizualizacji in vivo ruchów szeregu MP w tchawicy żywych szczurów.Te badania obrazowe PB-PCXI zaprojektowano w celu przetestowania serii MP, siły pola magnetycznego i lokalizacji w celu określenia ich wpływu na ruch MP.Założyliśmy, że zewnętrzne pole magnetyczne pomoże dostarczonemu MF pozostać lub przemieścić się do obszaru docelowego.Badania te pozwoliły nam również określić konfiguracje magnesów, które maksymalizują ilość cząstek pozostałych w tchawicy po osadzeniu.W drugiej serii badań chcieliśmy wykorzystać tę optymalną konfigurację do zademonstrowania wzoru transdukcji wynikającego z dostarczania LV-MP in vivo do dróg oddechowych szczurów, przy założeniu, że dostarczanie LV-MP w kontekście celowania w drogi oddechowe będzie skutkować w zwiększonej wydajności transdukcji LV..
Wszystkie badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Uniwersytet w Adelajdzie (M-2019-060 i M-2020-022) oraz Komisję ds. Etyki Zwierząt Synchrotronu SPring-8.Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z zaleceniami ARRIVE.
Wszystkie zdjęcia rentgenowskie wykonano na linii wiązki BL20XU w synchrotronie SPring-8 w Japonii, stosując konfigurację podobną do opisanej wcześniej21,22.W skrócie, pudełko eksperymentalne znajdowało się 245 m od pierścienia magazynującego synchrotron.Do badań obrazowania cząstek stosuje się odległość między próbką a detektorem wynoszącą 0,6 m, a do badań obrazowania in vivo – 0,3 m w celu uzyskania efektów kontrastu fazowego.Zastosowano wiązkę monochromatyczną o energii 25 keV.Obrazy uzyskano przy użyciu przetwornika rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości (SPring-8 BM3) sprzężonego z detektorem sCMOS.Przetwornik przetwarza promienie rentgenowskie na światło widzialne za pomocą scyntylatora o grubości 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), które następnie kierowane jest do czujnika sCMOS przy użyciu obiektywu mikroskopu ×10 (NA 0,3).Detektorem sCMOS był Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonia) o rozmiarze matrycy 2048 × 2048 pikseli i surowym rozmiarze piksela 6,5 ​​× 6,5 µm.To ustawienie zapewnia efektywny izotropowy rozmiar piksela wynoszący 0,51 µm i pole widzenia około 1,1 mm × 1,1 mm.Czas trwania ekspozycji wynoszący 100 ms wybrano w celu zmaksymalizowania stosunku sygnału do szumu cząstek magnetycznych wewnątrz i na zewnątrz dróg oddechowych, jednocześnie minimalizując artefakty ruchowe spowodowane oddychaniem.W przypadku badań in vivo na ścieżce promieniowania rentgenowskiego umieszczono szybką przesłonę rentgenowską, aby ograniczyć dawkę promieniowania poprzez blokowanie wiązki promieniowania rentgenowskiego pomiędzy ekspozycjami.
W żadnych badaniach obrazowych SPring-8 PB-PCXI nie używano podłoża LV, ponieważ komora obrazowania BL20XU nie posiada certyfikatu bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2.Zamiast tego wybraliśmy szereg dobrze scharakteryzowanych MP od dwóch komercyjnych dostawców, obejmujących szeroki zakres rozmiarów, materiałów, stężeń żelaza i zastosowań – najpierw w celu zrozumienia, w jaki sposób pola magnetyczne wpływają na ruch MP w szklanych kapilarach, a następnie w żywe drogi oddechowe.powierzchnia.Rozmiar MP waha się od 0,25 do 18 µm i jest wykonany z różnych materiałów (patrz tabela 1), ale skład każdej próbki, w tym wielkość cząstek magnetycznych w MP, jest nieznany.Na podstawie naszych obszernych badań MCT 19, 20, 21, 23, 24 spodziewamy się, że MP o wielkości do 5 µm będą widoczne na powierzchni tchawicy, na przykład poprzez odejmowanie kolejnych klatek, aby zobaczyć lepszą widoczność ruchu MP.Pojedynczy MP wynoszący 0,25 µm jest mniejszy niż rozdzielczość urządzenia obrazującego, ale oczekuje się, że PB-PCXI wykryje ich kontrast objętościowy i ruch cieczy powierzchniowej, na której są osadzone, po ich osadzeniu.
Próbki dla każdego posła w tabeli.1 przygotowano w 20 µl szklanych kapilarach (Drummond Microcaps, PA, USA) o średnicy wewnętrznej 0,63 mm.Cząsteczki korpuskularne dostępne są w wodzie, natomiast cząstki CombiMag dostępne są w zastrzeżonym przez producenta płynie.Każda probówka jest wypełniona do połowy płynem (około 11 µl) i umieszczona na uchwycie próbki (patrz rysunek 1).Szklane kapilary umieszczono odpowiednio na stoliku w komorze obrazującej poziomo i umiejscowiono na krawędziach cieczy.Magnes w powłoce niklowej o średnicy 19 mm (28 mm długości) wykonany z metali ziem rzadkich, neodymu, żelaza i boru (NdFeB) (N35, nr kat. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) o remanencji 1,17 T został przymocowany do oddzielny stół transferowy, aby zdalnie zmienić swoją pozycję podczas renderowania.Obrazowanie rentgenowskie rozpoczyna się po umieszczeniu magnesu około 30 mm nad próbką, a obrazy są rejestrowane z szybkością 4 klatek na sekundę.Podczas obrazowania magnes zbliżono do szklanej rurki kapilarnej (w odległości około 1 mm), a następnie przesuwano wzdłuż rurki, aby ocenić wpływ natężenia pola i położenia.
Zestaw do obrazowania in vitro zawierający próbki MP w szklanych kapilarach na etapie translacji próbki xy.Ścieżka wiązki promieniowania rentgenowskiego jest zaznaczona czerwoną przerywaną linią.
Po ustaleniu widoczności MPs in vitro, ich podgrupę zbadano in vivo na samicach szczurów albinosów rasy Wistar typu dzikiego (wiek ~12 tygodni, ~200 g).Medetomidyna 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japonia), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonia) i butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Szczury znieczulono mieszaniną Pharma (Japonia) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe.Po znieczuleniu przygotowano je do obrazowania poprzez usunięcie sierści wokół tchawicy, wprowadzenie rurki dotchawiczej (ET; kaniula dożylna 16 Ga, Terumo BCT) i unieruchomienie w pozycji leżącej na specjalnie wykonanej płycie obrazowej zawierającej worek termiczny aby utrzymać temperaturę ciała.22. Następnie płytkę obrazową przymocowano do stolika obrazowego w skrzynce obrazowej pod niewielkim kątem, aby ustawić tchawicę poziomo na obrazie rentgenowskim, jak pokazano na rycinie 2a.
( a ) Konfiguracja obrazowania in vivo w urządzeniu do obrazowania SPring-8, ścieżka wiązki promieniowania rentgenowskiego oznaczona czerwoną linią przerywaną.( b, c ) Lokalizację magnesu tchawicy przeprowadzono zdalnie przy użyciu dwóch ortogonalnie zamontowanych kamer IP.Po lewej stronie obrazu na ekranie widać pętlę drucianą utrzymującą głowicę oraz kaniulę wprowadzającą zainstalowaną wewnątrz rurki dotchawiczej.
Zdalnie sterowany system pompy strzykawkowej (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, Floryda) wykorzystujący 100 µl szklanej strzykawki połączono z rurką PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) przy użyciu igły 30 Ga.Zaznacz rurkę, aby upewnić się, że końcówka znajduje się we właściwej pozycji w tchawicy podczas wkładania rurki dotchawiczej.Za pomocą mikropompy usunięto tłok strzykawki i końcówkę rurki zanurzono w pobieranej próbce MP.Następnie naładowaną rurkę wprowadzającą wprowadzono do rurki dotchawiczej, umieszczając końcówkę w najsilniejszej części oczekiwanego przyłożonego pola magnetycznego.Akwizycję obrazu kontrolowano za pomocą detektora oddechu podłączonego do naszego modułu czasowego opartego na Arduino, a wszystkie sygnały (np. temperatura, oddychanie, otwarcie/zamknięcie migawki i akwizycja obrazu) zostały zarejestrowane przy użyciu programów Powerlab i LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia). 22 Podczas obrazowania Gdy obudowa była niedostępna, dwie kamery IP (Panasonic BB-SC382) ustawiono względem siebie pod kątem około 90° i wykorzystano do kontrolowania położenia magnesu względem tchawicy podczas obrazowania (ryc. 2b, c).Aby zminimalizować artefakty ruchowe, podczas plateau końcowego przepływu oddechowego rejestrowano jeden obraz na każdy oddech.
Magnes jest przymocowany do drugiego stopnia, który może być umieszczony w pewnej odległości na zewnątrz korpusu obrazującego.Badano różne pozycje i konfiguracje magnesu, m.in.: umieszczony pod kątem około 30° nad tchawicą (konfiguracje pokazano na rysunkach 2a i 3a);jeden magnes nad zwierzęciem, a drugi poniżej, z biegunami ustawionymi do przyciągania (rysunek 3b)., jeden magnes nad zwierzęciem, drugi poniżej, z biegunami ustawionymi na odpychanie (ryc. 3c) i jeden magnes powyżej i prostopadle do tchawicy (ryc. 3d).Po ustawieniu zwierzęcia i magnesu oraz załadowaniu badanego MP do pompy strzykawkowej, po akwizycji obrazów należy podać dawkę 50 µl z szybkością 4 µl/s.Następnie magnes przesuwa się tam i z powrotem wzdłuż lub w poprzek tchawicy, kontynuując pozyskiwanie obrazów.
Konfiguracja magnesów do obrazowania in vivo (a) jeden magnes nad tchawicą pod kątem około 30°, (b) dwa magnesy skonfigurowane do przyciągania, (c) dwa magnesy skonfigurowane do odpychania, (d) jeden magnes powyżej i prostopadle do tchawica.Obserwator spoglądał w dół od ust do płuc przez tchawicę, a wiązka promieniowania rentgenowskiego przeszła przez lewą stronę szczura i wyszła po prawej stronie.Magnes przesuwa się wzdłuż dróg oddechowych lub w lewo i prawo nad tchawicą, w kierunku wiązki promieni rentgenowskich.
Staraliśmy się także określić widoczność i zachowanie cząstek w drogach oddechowych przy braku mieszania się oddychania i tętna.Dlatego też pod koniec okresu obrazowania zwierzęta poddano humanitarnej eutanazji z powodu przedawkowania pentobarbitalu (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Część zwierząt pozostawiano na platformie obrazowej, a po ustaniu oddechu i bicia serca proces obrazowania powtarzano, dodając dodatkową dawkę MP w przypadku braku MP na powierzchni dróg oddechowych.
Powstałe obrazy skorygowano pod kątem płaskiego i ciemnego pola, a następnie złożono w film (20 klatek na sekundę; 15–25 × normalna prędkość w zależności od częstości oddechów) przy użyciu niestandardowego skryptu napisanego w programie MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Wszystkie badania nad dostarczaniem wektorów genów LV przeprowadzono w Centrum Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi Uniwersytetu w Adelajdzie i miały na celu wykorzystanie wyników eksperymentu SPring-8 do oceny, czy dostarczanie LV-MP w obecności pola magnetycznego może poprawić transfer genów in vivo .Aby ocenić wpływ MF i pola magnetycznego, leczono dwie grupy zwierząt: jednej grupie podano LV MF z magnesem, a drugiej grupie kontrolnej podano LV MF bez magnesu.
Wektory genu LV wygenerowano przy użyciu wcześniej opisanych metod 25, 26 .Wektor LacZ wyraża gen beta-galaktozydazy zlokalizowany w jądrze, kierowany przez konstytutywny promotor MPSV (LV-LacZ), który wytwarza niebieski produkt reakcji w transdukowanych komórkach, widoczny na przodach i skrawkach tkanki płucnej.Miareczkowanie przeprowadzono w hodowlach komórkowych poprzez ręczne zliczenie liczby komórek LacZ-dodatnich przy użyciu hemocytometru w celu obliczenia miana w TU/ml.Nośniki są kriokonserwowane w temperaturze -80°C, rozmrażane przed użyciem i wiązane z CombiMag poprzez zmieszanie 1:1 i inkubację na lodzie przez co najmniej 30 minut przed dostawą.
Normalne szczury Sprague Dawley (n = 3/grupę, ~2-3 znieczulone ip mieszaniną 0,4 mg/kg medetomidyny (Domitor, Ilium, Australia) i 60 mg/kg ketaminy (Ilium, Australia) w wieku 1 miesiąca) ip ) wstrzyknięcie i niechirurgiczna kaniula doustna kaniulą dożylną 16 Ga.Aby mieć pewność, że tkanka dróg oddechowych tchawicy otrzyma transdukcję LV, kondycjonowano ją przy użyciu naszego wcześniej opisanego protokołu zaburzeń mechanicznych, w którym powierzchnię dróg oddechowych tchawicy pocierano osiowo drucianym koszykiem (N-Circle, nitinolowy ekstraktor kamieni bez końcówki NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s. 28.Następnie, około 10 minut po zakłóceniach w komorze bezpieczeństwa biologicznego, przeprowadzono dotchawicze podanie LV-MP.
Pole magnetyczne użyte w tym eksperymencie skonfigurowano podobnie jak w badaniu rentgenowskim in vivo, z tymi samymi magnesami trzymanymi nad tchawicą za pomocą zacisków stentu destylacyjnego (ryc. 4).Objętość 50 µl (2 x 25 µl porcji) LV-MP dostarczono do tchawicy (n = 3 zwierzęta) przy użyciu pipety zakończonej żelem, jak opisano wcześniej.Grupa kontrolna (n = 3 zwierzęta) otrzymała ten sam LV-MP bez użycia magnesu.Po zakończeniu wlewu kaniulę wyjmuje się z rurki dotchawiczej i zwierzę ekstubuje.Magnes pozostaje na miejscu przez 10 minut, po czym zostaje usunięty.Szczurom podano podskórnie meloksykam (1 ml/kg) (Ilium, Australia), a następnie przerwano znieczulenie poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1 mg/kg chlorowodorku atipamazolu (Antisedan, Zoetis, Australia).Szczury utrzymywano w cieple i obserwowano aż do całkowitego wybudzenia ze znieczulenia.
Urządzenie dostarczające LV-MP w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Widać, że jasnoszara końcówka rurki ET typu Luer-lock wystaje z ust, a pokazana na rysunku żelowa końcówka pipety jest wprowadzana przez rurkę ET na żądaną głębokość do tchawicy.
Tydzień po procedurze podawania LV-MP zwierzęta humanitarnie uśmiercano przez wdychanie 100% CO2 i oceniano ekspresję LacZ przy użyciu naszego standardowego leczenia X-gal.Usunięto trzy pierścienie chrząstki znajdujące się najbliżej ogona, aby mieć pewność, że w analizie nie zostaną uwzględnione żadne uszkodzenia mechaniczne lub zatrzymanie płynów w wyniku umieszczenia rurki dotchawiczej.Każdą tchawicę przecięto wzdłuż, aby uzyskać dwie połówki do analizy i umieszczono w miseczce zawierającej gumę silikonową (Sylgard, Dow Inc) przy użyciu igły Minutien (Fine Science Tools) w celu uwidocznienia powierzchni światła.Rozmieszczenie i charakter transdukowanych komórek potwierdzono fotografią od przodu przy użyciu mikroskopu Nikon (SMZ1500) z kamerą DigiLite i oprogramowaniem TCapture (Tucsen Photonics, Chiny).Obrazy rejestrowano przy powiększeniu 20x (w tym przy maksymalnym ustawieniu dla pełnej szerokości tchawicy), przy czym cała długość tchawicy była wyświetlana krok po kroku, zapewniając wystarczające nakładanie się poszczególnych obrazów, aby umożliwić „zszycie” obrazów.Obrazy z każdej tchawicy połączono następnie w jeden obraz złożony przy użyciu programu Composite Image Editor w wersji 2.0.3 (Microsoft Research) i algorytmu ruchu planarnego. Obszar ekspresji LacZ w złożonych obrazach tchawicy każdego zwierzęcia określono ilościowo przy użyciu zautomatyzowanego skryptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak opisano wcześniej28, stosując ustawienia 0,35 < Barwa < 0,58, Nasycenie > 0,15 i Wartość < 0,7. Obszar ekspresji LacZ w złożonych obrazach tchawicy każdego zwierzęcia określono ilościowo przy użyciu zautomatyzowanego skryptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak opisano wcześniej 28, stosując ustawienia 0,35 < Barwa < 0,58, Nasycenie > 0,15 i Wartość < 0,7. Площадь эłowie эłowie эłowie эłowie э в с</s>авных изображениях трахеи от каждого животного ыылао колczeń оатизированнy цценария (R2020A, Mathworks), как оRисано ранеity28, с испоokolast значение <0 ,7. Obszar ekspresji LacZ na złożonych obrazach tchawicy każdego zwierzęcia określono ilościowo przy użyciu zautomatyzowanego skryptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak opisano wcześniej28, stosując ustawienia 0,350,15 i wartość<0,7.Narzędzia do obsługi MATLAB, R2020a, MathWorks) do obsługi LacZ i LacZ进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述 自动 自动 Matlab 脚本 （(r2020a ， Mathworks) 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 .................... BIODRO Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли споль зованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), jak описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, nasыщенность> 0,15 i значение <0,7 . Obszary ekspresji LacZ na złożonych obrazach tchawicy każdego zwierzęcia określono ilościowo przy użyciu zautomatyzowanego skryptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak opisano wcześniej, stosując ustawienia 0,35 <odcień <0,58, nasycenie> 0,15 i wartość <0,7.Śledząc kontury tkanek w programie GIMP v2.10.24, dla każdego złożonego obrazu ręcznie utworzono maskę, aby zidentyfikować obszar tkanki i zapobiec fałszywym wykryciom poza tkanką tchawicy.Zabarwione obszary ze wszystkich złożonych obrazów każdego zwierzęcia zsumowano, aby uzyskać całkowity wybarwiony obszar dla tego zwierzęcia.Następnie pomalowany obszar podzielono przez całkowitą powierzchnię maski, aby uzyskać znormalizowany obszar.
Każdą tchawicę zatopiono w parafinie i pocięto na skrawki o grubości 5 µm.Skrawki barwiono kontrastowo neutralną szybką czerwienią przez 5 minut, a obrazy uzyskiwano przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse E400, kamery DS-Fi3 i oprogramowania do przechwytywania elementów NIS (wersja 5.20.00).
Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono w programie GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Istotność statystyczną przyjęto na poziomie p ≤ 0,05.Normalność badano za pomocą testu Shapiro-Wilka, a różnice w barwieniu LacZ oceniano za pomocą testu t dla niesparowanych.
Sześć MP opisanych w Tabeli 1 zostało zbadanych przez PCXI, a widoczność opisano w Tabeli 2. Dwa polistyrenowe MP (MP1 i MP2; odpowiednio 18 µm i 0,25 µm) nie były widoczne przez PCXI, ale pozostałe próbki można było zidentyfikować (przykłady pokazano na rysunku 5).MP3 i MP4 są słabo widoczne (10-15% Fe3O4; odpowiednio 0,25 µm i 0,9 µm).Chociaż MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) zawierał jedne z najmniejszych badanych cząstek, był on najbardziej wyraźny.Produkt CombiMag MP6 jest trudny do odróżnienia.We wszystkich przypadkach nasza zdolność do wykrywania MF została znacznie poprawiona poprzez przesuwanie magnesu tam i z powrotem równolegle do kapilary.Gdy magnesy oddalały się od kapilary, cząstki były wyciągane w długich łańcuchach, ale gdy magnesy się zbliżały i natężenie pola magnetycznego wzrastało, łańcuchy cząstek skracały się, gdy cząstki migrowały w kierunku górnej powierzchni kapilary (patrz film uzupełniający S1 : MP4), zwiększając gęstość cząstek na powierzchni.I odwrotnie, gdy magnes zostanie usunięty z kapilary, natężenie pola maleje, a MPs przekształcają się w długie łańcuchy wystające z górnej powierzchni kapilary (patrz film uzupełniający S2: MP4).Gdy magnes przestanie się poruszać, cząstki poruszają się jeszcze przez pewien czas po osiągnięciu położenia równowagi.Gdy MP przemieszcza się w kierunku i od górnej powierzchni kapilary, cząstki magnetyczne mają tendencję do przyciągania zanieczyszczeń przez ciecz.
Widoczność MP pod PCXI różni się znacznie w zależności od próbki.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6.Wszystkie pokazane tutaj zdjęcia zostały wykonane za pomocą magnesu umieszczonego około 10 mm bezpośrednio nad kapilarą.Widoczne duże koła to pęcherzyki powietrza uwięzione w kapilarach, wyraźnie pokazujące czarno-białe krawędzie obrazu z kontrastem fazowym.Czerwone pole wskazuje powiększenie, które zwiększa kontrast.Należy pamiętać, że średnice obwodów magnesów na wszystkich rysunkach nie są zgodne ze skalą i są około 100 razy większe niż pokazano.
Gdy magnes porusza się w lewo i w prawo wzdłuż górnej części kapilary, kąt struny MP zmienia się, dopasowując się do magnesu (patrz rysunek 6), wyznaczając w ten sposób linie pola magnetycznego.W przypadku MP3-5, gdy cięciwa osiągnie kąt progowy, cząstki wleczą się wzdłuż górnej powierzchni kapilary.Często powoduje to, że parlamentarzyści łączą się w większe grupy w pobliżu najsilniejszego pola magnetycznego (patrz film uzupełniający S3: MP5).Jest to również szczególnie widoczne podczas obrazowania blisko końca kapilary, co powoduje agregację MP i koncentrację na granicy faz ciecz-powietrze.Cząstki w MP6, które były trudniejsze do rozróżnienia niż te w MP3-5, nie szły, gdy magnes poruszał się wzdłuż kapilary, ale struny MP dysocjowały, pozostawiając cząsteczki na widoku (patrz film uzupełniający S4: MP6).W niektórych przypadkach, gdy przyłożone pole magnetyczne zostało zmniejszone poprzez przesunięcie magnesu na dużą odległość od miejsca obrazowania, wszelkie pozostałe MPs powoli opadały na dolną powierzchnię tuby pod wpływem grawitacji, pozostając w strunie (patrz Film uzupełniający S5: MP3) .
Kąt struny MP zmienia się, gdy magnes przesuwa się w prawo nad kapilarą.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6.Czerwone pole wskazuje powiększenie, które zwiększa kontrast.Należy pamiętać, że dodatkowe filmy mają charakter informacyjny, ponieważ ujawniają ważną strukturę cząstek i informacje dynamiczne, których nie można zwizualizować na tych statycznych obrazach.
Nasze testy wykazały, że powolne przesuwanie magnesu tam i z powrotem wzdłuż tchawicy ułatwia wizualizację MF w kontekście złożonego ruchu in vivo.Nie przeprowadzono testów in vivo, ponieważ kulki polistyrenu (MP1 i MP2) nie były widoczne w kapilarze.Każdy z pozostałych czterech MF testowano in vivo z długą osią magnesu umieszczoną nad tchawicą pod kątem około 30° do pionu (patrz rysunki 2b i 3a), ponieważ skutkowało to dłuższymi łańcuchami MF i było bardziej skuteczne niż magnes..konfiguracja zakończona.W tchawicy żadnego żywego zwierzęcia nie wykryto MP3, MP4 i MP6.Podczas wizualizacji dróg oddechowych szczurów po humanitarnym uśmierceniu zwierząt cząstki pozostały niewidoczne nawet po dodaniu dodatkowej objętości za pomocą pompy strzykawkowej.MP5 miał najwyższą zawartość tlenku żelaza i był jedyną widoczną cząsteczką, dlatego wykorzystano go do oceny i scharakteryzowania zachowania MP in vivo.
Umieszczenie magnesu nad tchawicą podczas wprowadzania MF powodowało, że wiele, choć nie wszystkie, MF skupiały się w polu widzenia.Najlepiej jest obserwować przedostawanie się cząstek do tchawicy u zwierząt uśmierconych w sposób humanitarny.Rysunek 7 i dodatkowe wideo S6: MP5 pokazuje szybkie wychwytywanie magnetyczne i ustawianie cząstek na powierzchni brzusznej tchawicy, wskazując, że MPs można kierować do pożądanych obszarów tchawicy.Podczas przeszukiwania dalej, wzdłuż tchawicy po podaniu MF, niektóre MF znaleziono bliżej ostrogi, co wskazuje na niewystarczającą siłę pola magnetycznego do zebrania i utrzymania wszystkich MF, ponieważ zostały one dostarczone przez obszar maksymalnego natężenia pola magnetycznego podczas podawania płynu.proces.Jednakże poporodowe stężenia MP były wyższe w obszarze obrazu, co sugeruje, że wiele MP pozostawało w obszarach dróg oddechowych, gdzie przyłożone natężenie pola magnetycznego było najwyższe.
Obrazy (a) przed i (b) po dostarczeniu MP5 do tchawicy niedawno uśmierconego szczura za pomocą magnesu umieszczonego tuż nad obszarem obrazowania.Przedstawiony obszar znajduje się pomiędzy dwoma pierścieniami chrzęstnymi.Przed podaniem MP w drogach oddechowych znajduje się pewna ilość płynu.Czerwone pole wskazuje powiększenie, które zwiększa kontrast.Te obrazy pochodzą z filmu przedstawionego w S6: wideo uzupełniające MP5.
Przesuwanie magnesu wzdłuż tchawicy in vivo spowodowało zmianę kąta łańcucha MP na powierzchni dróg oddechowych, podobną do tej obserwowanej w naczyniach włosowatych (patrz rysunek 8 i film uzupełniający S7: MP5).Jednak w naszym badaniu MP nie można było przeciągnąć po powierzchni żywych dróg oddechowych, jak mogłyby to zrobić naczynia włosowate.W niektórych przypadkach łańcuch MP wydłuża się, gdy magnes porusza się w lewo i prawo.Co ciekawe, odkryliśmy również, że łańcuch cząstek zmienia głębokość warstwy powierzchniowej płynu, gdy magnes przesuwa się wzdłużnie wzdłuż tchawicy, i rozszerza się, gdy magnes przesuwa się bezpośrednio nad głową, a łańcuch cząstek obraca się do pozycji pionowej (patrz Film uzupełniający S7).: MP5 w 0:09, na dole po prawej).Charakterystyczny wzorzec ruchu zmieniał się, gdy magnes przesuwano w bok w poprzek górnej części tchawicy (tj. na lewo lub na prawo od zwierzęcia, a nie wzdłuż tchawicy).Cząsteczki były nadal wyraźnie widoczne podczas ich ruchu, ale kiedy magnes został usunięty z tchawicy, końcówki sznurków cząstek stały się widoczne (patrz film uzupełniający S8: MP5, zaczynający się od 0:08).Zgadza się to z obserwowanym zachowaniem pola magnetycznego pod działaniem przyłożonego pola magnetycznego w szklanej kapilarze.
Przykładowe zdjęcia przedstawiające MP5 w tchawicy żywego znieczulonego szczura.(a) Magnes służy do akwizycji obrazów powyżej i na lewo od tchawicy, następnie (b) po przesunięciu magnesu w prawo.Czerwone pole wskazuje powiększenie, które zwiększa kontrast.Te obrazy pochodzą z filmu zamieszczonego w dodatkowym filmie S7: MP5.
Kiedy oba bieguny ustawiono w orientacji północ-południe powyżej i poniżej tchawicy (tj. przyciąganie; ryc. 3b), struny MP wydawały się dłuższe i znajdowały się na bocznej ścianie tchawicy, a nie na grzbietowej powierzchni tchawicy. tchawica (patrz dodatek).Wideo S9: MP5).Jednakże, po podaniu płynu przy użyciu urządzenia z dwoma magnesami, co zwykle ma miejsce w przypadku urządzenia z jednym magnesem, nie wykryto wysokiego stężenia cząstek w jednym miejscu (tj. na powierzchni grzbietowej tchawicy).Następnie, gdy jeden magnes został skonfigurowany tak, aby odpychał przeciwne bieguny (rysunek 3c), po dostarczeniu liczba cząstek widocznych w polu widzenia nie wzrosła.Ustawienie obu konfiguracji magnesów jest trudne ze względu na duże natężenie pola magnetycznego, które odpowiednio przyciąga lub popycha magnesy.Następnie zmieniono konfigurację na pojedynczy magnes równoległy do ​​dróg oddechowych, ale przechodzący przez drogi oddechowe pod kątem 90 stopni, tak że linie siły przecinały ścianę tchawicy prostopadle (ryc. 3d), a orientacja ta miała na celu określenie możliwości agregacji cząstek na ścianę boczną.być obserwowanym.Jednakże w tej konfiguracji nie było możliwego do zidentyfikowania ruchu akumulacji MF ani ruchu magnesu.Na podstawie wszystkich tych wyników do badań nosicieli genów in vivo wybrano konfigurację z pojedynczym magnesem i orientacją 30 stopni (ryc. 3a).
Gdy zwierzę było wielokrotnie fotografowane bezpośrednio po humanitarnym uśmierceniu, brak zakłócającego ruchu tkanki oznaczał, że w wyraźnym polu międzychrzęstnym można było dostrzec drobniejsze, krótsze linie cząstek, „kołysające się” zgodnie z ruchem translacyjnym magnesu.wyraźnie zobaczyć obecność i ruch cząstek MP6.
Miano LV-LacZ wynosiło 1,8 x 108 IU/ml i po zmieszaniu 1:1 z CombiMag MP (MP6) zwierzętom wstrzyknięto 50 µl dawki dotchawiczej 9 x 107 IU/ml nośnika LV (tj. 4,5 x 106 TU/szczura).).).W tych badaniach zamiast przesuwać magnes podczas porodu, unieruchomiliśmy magnes w jednej pozycji, aby określić, czy przewodzenie LV można (a) poprawić w porównaniu z dostarczaniem wektorów przy braku pola magnetycznego oraz (b) czy można udrożnić drogi oddechowe. być skupionym.Komórki ulegają transdukcji w docelowych obszarach magnetycznych górnych dróg oddechowych.
Nie wydaje się, aby obecność magnesów i użycie CombiMag w połączeniu z wektorami LV miało niekorzystny wpływ na zdrowie zwierząt, podobnie jak nasz standardowy protokół dostarczania wektorów LV.Przednie obrazy obszaru tchawicy poddanego zakłóceniom mechanicznym (rysunek uzupełniający 1) pokazały, że grupa leczona LV-MP miała znacznie wyższy poziom transdukcji w obecności magnesu (ryc. 9a).W grupie kontrolnej występowała tylko niewielka ilość niebieskiego zabarwienia LacZ (ryc. 9b).Kwantyfikacja znormalizowanych regionów barwionych X-Gal wykazała, że ​​podawanie LV-MP w obecności pola magnetycznego spowodowało w przybliżeniu 6-krotną poprawę (ryc. 9c).
Przykład obrazów kompozytowych przedstawiających transdukcję tchawicy za pomocą LV-MP (a) w obecności pola magnetycznego i (b) przy braku magnesu.(c) Statystycznie istotna poprawa znormalizowanego obszaru transdukcji LacZ w tchawicy przy użyciu magnesu (*p = 0,029, test t, n = 3 na grupę, średnia ± błąd standardowy średniej).
Neutralne, szybko zabarwione na czerwono sekcje (przykład pokazany na dodatkowej ryc. 2) wskazały, że komórki wybarwione LacZ były obecne w tej samej próbce i w tym samym miejscu, jak poprzednio zgłaszano.
Kluczowym wyzwaniem w terapii genowej dróg oddechowych pozostaje precyzyjna lokalizacja cząstek nośnikowych w obszarach zainteresowania i osiągnięcie wysokiego poziomu efektywności transdukcji w ruchomym płucu w obecności przepływu powietrza i aktywnego usuwania śluzu.W przypadku nośników LV przeznaczonych do leczenia chorób układu oddechowego w mukowiscydozie wydłużenie czasu przebywania cząstek nośnika w przewodzących drogach oddechowych było dotychczas celem nieosiągalnym.Jak wskazali Castellani i wsp., zastosowanie pól magnetycznych do wzmocnienia transdukcji ma przewagę nad innymi metodami dostarczania genów, takimi jak elektroporacja, ponieważ może łączyć w sobie prostotę, oszczędność, zlokalizowane dostarczanie, zwiększoną wydajność i krótszy czas inkubacji.i ewentualnie niższą dawkę nośnika 10.Jednakże nigdy nie opisano in vivo osadzania się i zachowania cząstek magnetycznych w drogach oddechowych pod wpływem zewnętrznych sił magnetycznych i w rzeczywistości nie wykazano in vivo zdolności tej metody do zwiększania poziomu ekspresji genów w nienaruszonych, żywych drogach oddechowych.
Nasze eksperymenty in vitro na synchrotronie PCXI wykazały, że wszystkie testowane przez nas cząstki, z wyjątkiem polistyrenu MP, były widoczne w używanym przez nas układzie obrazowania.W obecności pola magnetycznego pola magnetyczne tworzą struny, których długość jest związana z rodzajem cząstek i siłą pola magnetycznego (tzn. bliskością i ruchem magnesu).Jak pokazano na rysunku 10, obserwowane przez nas struny powstają, gdy każda pojedyncza cząstka zostaje namagnesowana i indukuje własne lokalne pole magnetyczne.Te oddzielne pola powodują, że inne podobne cząstki gromadzą się i łączą z grupowymi ruchami strun pod wpływem lokalnych sił pochodzących z lokalnych sił przyciągania i odpychania innych cząstek.
Schemat przedstawiający (a, b) łańcuchy cząstek tworzące się wewnątrz naczyń włosowatych wypełnionych płynem oraz (c, d) tchawicę wypełnioną powietrzem.Należy pamiętać, że naczynia włosowate i tchawica nie są narysowane w skali.Panel (a) zawiera także opis MF zawierającego ułożone w łańcuchy cząstki Fe3O4.
Kiedy magnes przesunął się nad kapilarą, kąt ciągu cząstek osiągnął próg krytyczny dla MP3-5 zawierającego Fe3O4, po czym ciąg cząstek nie pozostawał już w swoim pierwotnym położeniu, ale przesunął się wzdłuż powierzchni do nowego położenia.magnes.Efekt ten prawdopodobnie występuje, ponieważ powierzchnia szklanej kapilary jest wystarczająco gładka, aby umożliwić wystąpienie tego ruchu.Co ciekawe, MP6 (CombiMag) nie zachowywał się w ten sposób, być może dlatego, że cząstki były mniejsze, miały inną powłokę lub ładunek powierzchniowy albo zastrzeżony płyn nośny wpływał na ich zdolność do poruszania się.Kontrast na obrazie cząstek CombiMag jest również słabszy, co sugeruje, że ciecz i cząstki mogą mieć tę samą gęstość i dlatego nie mogą łatwo zbliżać się do siebie.Cząsteczki mogą również utknąć, jeśli magnes porusza się zbyt szybko, co wskazuje, że siła pola magnetycznego nie zawsze jest w stanie pokonać tarcie między cząsteczkami w płynie, co sugeruje, że natężenie pola magnetycznego i odległość między magnesem a obszarem docelowym nie powinny mieć wpływu niespodzianka.ważny.Wyniki te wskazują również, że chociaż magnesy mogą wychwytywać wiele mikrocząstek przepływających przez obszar docelowy, jest mało prawdopodobne, aby można było polegać na magnesach w przemieszczaniu cząstek CombiMag wzdłuż powierzchni tchawicy.W związku z tym doszliśmy do wniosku, że badania LV MF in vivo powinny wykorzystywać statyczne pola magnetyczne do fizycznego celowania w określone obszary drzewa dróg oddechowych.
Po dostarczeniu cząstek do organizmu trudno je zidentyfikować w kontekście złożonej poruszającej się tkanki ciała, ale ich zdolność wykrywania została poprawiona poprzez przesuwanie magnesu poziomo nad tchawicą w celu „poruszania” strun MP.Chociaż możliwe jest obrazowanie w czasie rzeczywistym, łatwiej jest dostrzec ruch cząstek po humanitarnym zabiciu zwierzęcia.Stężenia MP były zwykle najwyższe w tym miejscu, gdy magnes był umieszczony nad obszarem obrazowania, chociaż niektóre cząsteczki zwykle znajdowano w dalszej części tchawicy.W odróżnieniu od badań in vitro, cząstek nie można przeciągać po tchawicy ruchem magnesu.Odkrycie to jest zgodne ze sposobem, w jaki śluz pokrywający powierzchnię tchawicy zazwyczaj przetwarza wdychane cząstki, zatrzymując je w śluzie, a następnie usuwając je poprzez mechanizm usuwania śluzowo-rzęskowego.
Postawiliśmy hipotezę, że użycie magnesów nad i pod tchawicą do przyciągania (ryc. 3b) może skutkować bardziej jednolitym polem magnetycznym zamiast pola magnetycznego silnie skoncentrowanego w jednym punkcie, co potencjalnie może skutkować bardziej równomiernym rozkładem cząstek..Jednak nasze wstępne badanie nie znalazło jednoznacznych dowodów na poparcie tej hipotezy.Podobnie ustawienie pary magnesów na odpychanie (ryc. 3c) nie spowodowało osadzania się większej liczby cząstek w obszarze obrazu.Te dwa ustalenia pokazują, że konfiguracja z dwoma magnesami nie poprawia znacząco lokalnej kontroli wskazywania MP oraz że wynikające z tego silne siły magnetyczne są trudne do dostrojenia, co czyni to podejście mniej praktycznym.Podobnie ustawienie magnesu nad i w poprzek tchawicy (ryc. 3d) również nie zwiększyło liczby cząstek pozostałych w obrazowanym obszarze.Niektóre z tych alternatywnych konfiguracji mogą nie być skuteczne, ponieważ powodują zmniejszenie natężenia pola magnetycznego w strefie osadzania.Zatem konfiguracja pojedynczego magnesu pod kątem 30 stopni (ryc. 3a) jest uważana za najprostszą i najskuteczniejszą metodę badania in vivo.
Badanie LV-MP wykazało, że gdy wektory LV połączono z CombiMag i dostarczono po fizycznym zakłóceniu w obecności pola magnetycznego, poziom transdukcji w tchawicy znacznie wzrósł w porównaniu z grupą kontrolną.Na podstawie badań obrazowania synchrotronowego i wyników LacZ wydaje się, że pole magnetyczne jest w stanie utrzymać LV w tchawicy i zmniejszyć liczbę cząstek wektorów, które natychmiast przenikają głęboko do płuc.Takie ulepszenia ukierunkowania mogą prowadzić do wyższej wydajności przy jednoczesnym zmniejszeniu dostarczonych mian, nieukierunkowanej transdukcji, zapalnych i immunologicznych skutków ubocznych oraz kosztów transferu genów.Co ważne, według producenta CombiMag można stosować w połączeniu z innymi metodami transferu genów, w tym innymi wektorami wirusowymi (takimi jak AAV) i kwasami nukleinowymi.