Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, będziemy renderować witrynę bez stylów i języka JavaScript.
Wektory genów do leczenia mukowiscydozy płuc muszą być ukierunkowane na przewodzące drogi oddechowe, ponieważ obwodowa transdukcja płuc nie ma efektu terapeutycznego.Wydajność transdukcji wirusowej jest bezpośrednio związana z czasem przebywania nośnika.Jednak płyny dostarczające, takie jak nośniki genów, naturalnie dyfundują do pęcherzyków płucnych podczas inhalacji, a cząstki terapeutyczne o dowolnym kształcie są szybko usuwane przez transport śluzowo-rzęskowy.Wydłużenie czasu przebywania nosicieli genów w drogach oddechowych jest ważne, ale trudne do osiągnięcia.Sprzężone z nośnikiem cząstki magnetyczne, które można skierować na powierzchnię dróg oddechowych, mogą poprawić ukierunkowanie regionalne.Ze względu na problemy z obrazowaniem in vivo, zachowanie tak małych cząstek magnetycznych na powierzchni dróg oddechowych w obecności przyłożonego pola magnetycznego jest słabo poznane.Celem tego badania było wykorzystanie obrazowania synchrotronowego do wizualizacji in vivo ruchu szeregu cząstek magnetycznych w tchawicy znieczulonych szczurów w celu zbadania dynamiki i wzorców zachowania pojedynczych i masowych cząstek in vivo.Następnie oceniliśmy również, czy dostarczenie lentiwirusowych cząstek magnetycznych w obecności pola magnetycznego zwiększyłoby wydajność transdukcji w tchawicy szczura.Synchrotronowe obrazowanie rentgenowskie pokazuje zachowanie cząstek magnetycznych w stacjonarnych i ruchomych polach magnetycznych in vitro i in vivo.Cząstek nie da się łatwo przeciągnąć po powierzchni żywych dróg oddechowych za pomocą magnesów, ale podczas transportu osady gromadzą się w polu widzenia, gdzie pole magnetyczne jest najsilniejsze.Wydajność transdukcji również wzrosła sześciokrotnie, gdy lentiwirusowe cząstki magnetyczne zostały dostarczone w obecności pola magnetycznego.Podsumowując, wyniki te sugerują, że lentiwirusowe cząstki magnetyczne i pola magnetyczne mogą być cennymi podejściami do poprawy ukierunkowania wektorów genowych i poziomów transdukcji w przewodzących drogach oddechowych in vivo.
Mukowiscydoza (CF) jest spowodowana zmianami w pojedynczym genie zwanym regulatorem przewodnictwa przezbłonowego CF (CFTR).Białko CFTR jest kanałem jonowym obecnym w wielu komórkach nabłonkowych w całym ciele, w tym w drogach oddechowych, które są głównym miejscem patogenezy mukowiscydozy.Wady CFTR prowadzą do nieprawidłowego transportu wody, odwodnienia powierzchni dróg oddechowych i zmniejszenia głębokości warstwy płynu powierzchniowego dróg oddechowych (ASL).Upośledza również zdolność układu transportu śluzowo-rzęskowego (MCT) do oczyszczania dróg oddechowych z wdychanych cząstek i patogenów.Naszym celem jest opracowanie lentiwirusowej (LV) terapii genowej w celu dostarczenia prawidłowej kopii genu CFTR i poprawy ASL, MCT i zdrowia płuc, a także dalszy rozwój nowych technologii, które mogą mierzyć te parametry in vivo1.
Wektory LV są jednymi z wiodących kandydatów do terapii genowej mukowiscydozy, głównie dlatego, że mogą trwale zintegrować gen terapeutyczny z komórkami podstawnymi dróg oddechowych (komórkami macierzystymi dróg oddechowych).Jest to ważne, ponieważ mogą przywrócić normalne nawodnienie i usuwanie śluzu poprzez różnicowanie się w funkcjonalne, skorygowane genowo komórki powierzchni dróg oddechowych związane z mukowiscydozą, co daje korzyści na całe życie.Wektory LV muszą być skierowane na przewodzące drogi oddechowe, ponieważ w CF zaczyna się zajęcie płuc.Dostarczenie wektora głębiej do płuc może spowodować transdukcję pęcherzykową, ale nie ma to efektu terapeutycznego w mukowiscydozie.Jednak płyny, takie jak nośniki genów, naturalnie migrują do pęcherzyków płucnych podczas wdychania po porodzie3,4, a cząstki terapeutyczne są szybko wydalane do jamy ustnej przez MCT.Skuteczność transdukcji LV jest bezpośrednio związana z długością czasu, przez jaki wektor pozostaje blisko komórek docelowych, aby umożliwić wychwyt komórkowy – „czas przebywania” 5, który można łatwo skrócić dzięki typowemu regionalnemu przepływowi powietrza oraz skoordynowanemu wychwytowi śluzu i cząsteczek MCT.W przypadku mukowiscydozy możliwość wydłużenia czasu przebywania LV w drogach oddechowych jest ważna dla osiągnięcia wysokiego poziomu transdukcji w tym obszarze, ale jak dotąd stanowiła wyzwanie.
Aby pokonać tę przeszkodę, proponujemy, aby cząstki magnetyczne niskiego napięcia (MP) mogły pomóc na dwa uzupełniające się sposoby.Po pierwsze, mogą być kierowane przez magnes na powierzchnię dróg oddechowych, aby poprawić celowanie i pomóc cząsteczkom będącym nośnikami genów znaleźć się we właściwym obszarze dróg oddechowych;i ASL) przechodzą do warstwy komórkowej 6. MPs są szeroko stosowane jako nośniki ukierunkowanego dostarczania leków, gdy wiążą się z przeciwciałami, lekami chemioterapeutycznymi lub innymi małymi cząsteczkami, które przyczepiają się do błon komórkowych lub wiążą się z odpowiednimi receptorami na powierzchni komórki i gromadzą się w miejscach guza w obecność elektryczności statycznej.Pola magnetyczne w terapii raka 7. Inne metody „hipertermiczne” mają na celu zabijanie komórek nowotworowych poprzez ogrzewanie MP pod wpływem oscylujących pól magnetycznych.Zasada transfekcji magnetycznej, w której pole magnetyczne jest wykorzystywane jako czynnik transfekcyjny w celu zwiększenia przenoszenia DNA do komórek, jest powszechnie stosowana in vitro przy użyciu szeregu niewirusowych i wirusowych wektorów genowych dla trudnych do transdukcji linii komórkowych ..Ustalono skuteczność magnetotransfekcji LV z dostarczeniem LV MP in vitro do linii komórkowej ludzkiego nabłonka oskrzeli w obecności statycznego pola magnetycznego, zwiększając wydajność transdukcji 186-krotnie w porównaniu z samym wektorem LV.LV MT zastosowano również w modelu mukowiscydozy in vitro, gdzie transfekcja magnetyczna zwiększyła transdukcję LV w hodowlach na granicy faz powietrze-ciecz o współczynnik 20 w obecności plwociny mukowiscydozy10.Jednak magnetotransfekcji narządów in vivo poświęcono stosunkowo niewiele uwagi i oceniono ją tylko w kilku badaniach na zwierzętach11,12,13,14,15, zwłaszcza w płucach16,17.Jednak możliwości transfekcji magnetycznej w terapii płuc w mukowiscydozie są jasne.Tan i in.(2020) stwierdzili, że „badanie walidacyjne dotyczące skutecznego dostarczania nanocząstek magnetycznych do płuc utoruje drogę przyszłym strategiom inhalacji CFTR w celu poprawy wyników klinicznych u pacjentów z mukowiscydozą”6.
Zachowanie się małych cząstek magnetycznych na powierzchni dróg oddechowych w obecności przyłożonego pola magnetycznego jest trudne do zobrazowania i zbadania, przez co są słabo poznane.W innych badaniach opracowaliśmy metodę obrazowania rentgenowskiego z kontrastem fazowym opartą na propagacji synchrotronu (PB-PCXI) do nieinwazyjnego obrazowania i kwantyfikacji drobnych zmian in vivo w głębokości ASL18 i zachowaniu MCT19, 20 w celu bezpośredniego pomiaru hydratacji powierzchni kanału gazowego i jest stosowany jako wczesny wskaźnik skuteczności leczenia.Ponadto nasza metoda punktacji MCT wykorzystuje cząstki o średnicy 10–35 µm złożone z tlenku glinu lub szkła o wysokim współczynniku załamania jako znaczniki MCT widoczne za pomocą PB-PCXI21.Obie metody nadają się do obrazowania szeregu typów cząstek, w tym MP.
Ze względu na wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową nasze testy ASL i MCT oparte na PB-PCXI dobrze nadają się do badania dynamiki i wzorców zachowań pojedynczych i masowych cząstek in vivo, aby pomóc nam zrozumieć i zoptymalizować metody dostarczania genów MP.Podejście, którego tutaj używamy, opiera się na naszych badaniach z wykorzystaniem linii wiązki SPring-8 BL20B2, w której zwizualizowaliśmy ruch płynu po dostarczeniu dawki obojętnego wektora do nosowych i płucnych dróg oddechowych myszy, aby pomóc wyjaśnić obserwowane przez nas heterogeniczne wzorce ekspresji genów w naszym genie.badania na zwierzętach z dawką nośnika 3,4 .
Celem tego badania było wykorzystanie synchrotronu PB-PCXI do wizualizacji ruchów in vivo serii MP w tchawicy żywych szczurów.Te badania obrazowania PB-PCXI zostały zaprojektowane w celu przetestowania serii MP, natężenia pola magnetycznego i lokalizacji w celu określenia ich wpływu na ruch MP.Założyliśmy, że zewnętrzne pole magnetyczne pomoże dostarczonemu MF pozostać lub przenieść się do obszaru docelowego.Badania te pozwoliły nam również określić konfiguracje magnesów, które maksymalizują ilość cząstek pozostających w tchawicy po osadzeniu.W drugiej serii badań staraliśmy się wykorzystać tę optymalną konfigurację do zademonstrowania wzorca transdukcji wynikającego z dostarczania in vivo LV-MP do dróg oddechowych szczurów, przy założeniu, że dostarczenie LV-MP w kontekście kierowania do dróg oddechowych spowoduje w zwiększonej wydajności transdukcji LV..
Wszystkie badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez University of Adelaide (M-2019-060 i M-2020-022) oraz SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z zaleceniami ARRIVE.
Wszystkie zdjęcia rentgenowskie wykonano na linii wiązki BL20XU w synchrotronie SPring-8 w Japonii przy użyciu konfiguracji podobnej do opisanej wcześniej21,22.W skrócie, pudełko eksperymentalne znajdowało się 245 m od pierścienia magazynującego synchrotron.Odległość próbki od detektora wynosząca 0,6 m jest używana do badań obrazowania cząstek, a 0,3 m do badań obrazowania in vivo w celu uzyskania efektów kontrastu fazowego.Zastosowano wiązkę monochromatyczną o energii 25 keV.Obrazy uzyskano za pomocą przetwornika rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości (SPring-8 BM3) połączonego z detektorem sCMOS.Przetwornik przetwarza promieniowanie rentgenowskie na światło widzialne za pomocą scyntylatora o grubości 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), które jest następnie kierowane do czujnika sCMOS za pomocą obiektywu mikroskopu ×10 (NA 0,3).Detektorem sCMOS był Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonia) o rozmiarze macierzy 2048 × 2048 pikseli i surowym rozmiarze piksela 6,5 ​​× 6,5 µm.To ustawienie zapewnia efektywny izotropowy rozmiar piksela 0,51 µm i pole widzenia około 1,1 mm × 1,1 mm.Czas ekspozycji 100 ms został wybrany, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu cząstek magnetycznych wewnątrz i na zewnątrz dróg oddechowych, jednocześnie minimalizując artefakty ruchowe spowodowane oddychaniem.W badaniach in vivo na ścieżce promieniowania rentgenowskiego umieszczono szybką przesłonę rentgenowską, aby ograniczyć dawkę promieniowania poprzez blokowanie wiązki promieniowania rentgenowskiego pomiędzy ekspozycjami.
W żadnym badaniu obrazowym SPring-8 PB-PCXI nie użyto podłoża LV, ponieważ komora obrazowania BL20XU nie ma certyfikatu bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2.Zamiast tego wybraliśmy szereg dobrze scharakteryzowanych MP od dwóch komercyjnych dostawców obejmujących zakres rozmiarów, materiałów, stężeń żelaza i zastosowań — najpierw w celu zrozumienia, w jaki sposób pola magnetyczne wpływają na ruch MP w szklanych kapilarach, a następnie w żywe drogi oddechowe.powierzchnia.Rozmiar MP waha się od 0,25 do 18 µm i jest wykonany z różnych materiałów (patrz Tabela 1), ale skład każdej próbki, w tym rozmiar cząstek magnetycznych w MP, jest nieznany.Na podstawie naszych szeroko zakrojonych badań MCT 19, 20, 21, 23, 24 spodziewamy się, że MP o wielkości do 5 µm można zobaczyć na powierzchni dróg oddechowych tchawicy, na przykład poprzez odjęcie kolejnych klatek, aby zobaczyć lepszą widoczność ruchu MP.Pojedynczy MP wynoszący 0,25 µm jest mniejszy niż rozdzielczość urządzenia do obrazowania, ale oczekuje się, że PB-PCXI wykryje ich kontrast objętościowy i ruch cieczy powierzchniowej, na której są osadzone po złożeniu.
Próbki dla każdego MP w tabeli.1 przygotowano w 20 μl szklanych kapilarach (Drummond Microcaps, PA, USA) o średnicy wewnętrznej 0,63 mm.Cząsteczki cząsteczkowe są dostępne w wodzie, natomiast cząstki CombiMag są dostępne w zastrzeżonym przez producenta płynie.Każda probówka jest wypełniona do połowy płynem (około 11 µl) i umieszczona w uchwycie próbki (patrz rysunek 1).Szklane kapilary umieszczono odpowiednio poziomo na stole montażowym w komorze obrazującej i umieszczono na krawędziach cieczy.Magnes niklowo-skorupowy o średnicy 19 mm (28 mm długości) wykonany z metali ziem rzadkich, neodymu, żelaza i boru (NdFeB) (N35, nr kat. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) o remanencji 1,17 T został przymocowany do oddzielny stół transferowy do osiągnięcia Zdalna zmiana pozycji podczas renderowania.Obrazowanie rentgenowskie rozpoczyna się, gdy magnes znajduje się około 30 mm nad próbką, a obrazy są rejestrowane z szybkością 4 klatek na sekundę.Podczas obrazowania magnes zbliżano do szklanej rurki kapilarnej (na odległość około 1 mm), a następnie przesuwano wzdłuż rurki, aby ocenić wpływ siły pola i położenia.
Zestaw do obrazowania in vitro zawierający próbki MP w szklanych kapilarach na etapie translacji próbki xy.Droga wiązki promieniowania rentgenowskiego jest zaznaczona czerwoną kropkowaną linią.
Po ustaleniu widoczności MP in vitro, ich podzbiór przetestowano in vivo na samicach szczurów albinosów typu dzikiego Wistar (w wieku ~ 12 tygodni, ~ 200 g).Medetomidyna 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japonia), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonia) i butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Szczury znieczulono mieszaniną Pharma (Japonia) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe.Po znieczuleniu przygotowano je do obrazowania poprzez usunięcie futra wokół tchawicy, wprowadzenie rurki dotchawiczej (ET; kaniula dożylna 16 Ga, Terumo BCT) i unieruchomienie ich w pozycji leżącej na wykonanej na zamówienie płytce obrazowej zawierającej worek termiczny do utrzymania temperatury ciała.22. Płytkę obrazującą przymocowano następnie do stolika z próbką w pudełku obrazującym pod niewielkim kątem, aby wyrównać poziomo tchawicę na zdjęciu rentgenowskim, jak pokazano na rycinie 2a.
( a ) Konfiguracja obrazowania in vivo w zespole obrazowania SPring-8, ścieżka wiązki promieniowania rentgenowskiego zaznaczona czerwoną kropkowaną linią.(b, c) Lokalizacja magnesu tchawicy została przeprowadzona zdalnie za pomocą dwóch ortogonalnie zamontowanych kamer IP.Po lewej stronie obrazu na ekranie widać drucianą pętlę podtrzymującą głowę oraz kaniulę wprowadzającą zainstalowaną wewnątrz rurki dotchawiczej.
Zdalnie sterowany system pompy strzykawkowej (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, Floryda) wykorzystujący szklaną strzykawkę 100 ul połączono z rurką PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) za pomocą igły 30 Ga.Zaznacz rurkę, aby upewnić się, że końcówka znajduje się we właściwej pozycji w tchawicy podczas wkładania rurki dotchawiczej.Za pomocą mikropompki usunięto tłok strzykawki i zanurzono końcówkę rurki w próbce MP, która miała być dostarczona.Naładowaną rurkę doprowadzającą wprowadzono następnie do rurki dotchawiczej, umieszczając końcówkę w najsilniejszej części naszego oczekiwanego przyłożonego pola magnetycznego.Akwizycja obrazu była kontrolowana za pomocą detektora oddechu podłączonego do naszego modułu czasowego opartego na Arduino, a wszystkie sygnały (np. temperatura, oddech, otwarcie/zamknięcie migawki i akwizycja obrazu) zostały zarejestrowane za pomocą Powerlab i LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Podczas obrazowania Gdy obudowa była niedostępna, dwie kamery IP (Panasonic BB-SC382) zostały ustawione pod kątem około 90° względem siebie i używane do kontrolowania położenia magnesu względem tchawicy podczas obrazowania (ryc. 2b, c).Aby zminimalizować artefakty związane z ruchem, podczas końcowego plateau przepływu oddechowego uzyskano jeden obraz na oddech.
Magnes jest przymocowany do drugiego stopnia, który może być umieszczony zdalnie na zewnątrz korpusu obrazującego.Badano różne pozycje i konfiguracje magnesu, w tym: umieszczony pod kątem około 30° nad tchawicą (konfiguracje pokazano na ryc. 2a i 3a);jeden magnes nad zwierzęciem, a drugi poniżej, z biegunami ustawionymi na przyciąganie (Rysunek 3b)., jeden magnes nad zwierzęciem i jeden poniżej, z biegunami ustawionymi na odpychanie (ryc. 3c) i jeden magnes powyżej i prostopadle do tchawicy (ryc. 3d).Po ustawieniu zwierzęcia i magnesu oraz załadowaniu badanego MP do pompy strzykawkowej, po akwizycji obrazów należy podać dawkę 50 µl z szybkością 4 µl/s.Magnes jest następnie przesuwany w przód iw tył wzdłuż lub w poprzek tchawicy, kontynuując pozyskiwanie obrazów.
Konfiguracja magnesu do obrazowania in vivo (a) jeden magnes nad tchawicą pod kątem około 30°, (b) dwa magnesy skonfigurowane do przyciągania, (c) dwa magnesy skonfigurowane do odpychania, (d) jeden magnes powyżej i prostopadle do tchawica.Obserwator patrzył w dół od ust do płuc przez tchawicę, a wiązka promieniowania rentgenowskiego przechodziła przez lewą stronę szczura i wychodziła z prawej strony.Magnes przesuwa się wzdłuż dróg oddechowych lub w lewo i prawo nad tchawicą w kierunku wiązki promieniowania rentgenowskiego.
Staraliśmy się również określić widoczność i zachowanie cząstek w drogach oddechowych przy braku mieszania oddechu i tętna.Dlatego pod koniec okresu obrazowania zwierzęta poddano humanitarnej eutanazji z powodu przedawkowania pentobarbitalu (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Niektóre zwierzęta pozostawiono na platformie obrazowania, a po ustaniu oddychania i bicia serca proces obrazowania powtarzano, dodając dodatkową dawkę MP, jeśli na powierzchni dróg oddechowych nie było widać MP.
Powstałe obrazy zostały skorygowane pod kątem płaskiego i ciemnego pola, a następnie zebrane w film (20 klatek na sekundę; 15–25 × normalna prędkość w zależności od częstości oddychania) przy użyciu niestandardowego skryptu napisanego w MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Wszystkie badania dotyczące dostarczania wektora genów LV zostały przeprowadzone w Centrum Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi Uniwersytetu w Adelaide i miały na celu wykorzystanie wyników eksperymentu SPring-8 do oceny, czy dostarczanie LV-MP w obecności pola magnetycznego może poprawić transfer genów in vivo .Aby ocenić wpływ MF i pola magnetycznego, potraktowano dwie grupy zwierząt: jednej grupie wstrzyknięto LV MF z umieszczeniem magnesu, a drugiej grupie wstrzyknięto grupę kontrolną LV MF bez magnesu.
Wektory genów LV zostały wygenerowane przy użyciu wcześniej opisanych metod 25, 26 .Wektor LacZ wykazuje ekspresję zlokalizowanego w jądrze genu beta-galaktozydazy kierowanego przez konstytutywny promotor MPSV (LV-LacZ), który wytwarza niebieski produkt reakcji w transdukowanych komórkach, widoczny na frontach i skrawkach tkanki płucnej.Miareczkowanie przeprowadzono w hodowlach komórkowych przez ręczne zliczanie liczby komórek LacZ-dodatnich przy użyciu hemocytometru w celu obliczenia miana w TU/ml.Nośniki są kriokonserwowane w temperaturze -80°C, rozmrażane przed użyciem i wiązane z CombiMag przez zmieszanie 1:1 i inkubację na lodzie przez co najmniej 30 minut przed dostarczeniem.
Normalne szczury Sprague Dawley (n = 3/grupę, ~2-3 znieczulone dootrzewnowo mieszaniną 0,4 mg/kg medetomidyny (Domitor, Ilium, Australia) i 60 mg/kg ketaminy (Ilium, Australia) w wieku 1 miesiąca) ip ) iniekcja i niechirurgiczne kaniulacja jamy ustnej za pomocą kaniuli dożylnej 16 Ga.Aby upewnić się, że tkanka dróg oddechowych tchawicy otrzymuje transdukcję LV, kondycjonowano ją za pomocą naszego wcześniej opisanego protokołu zaburzeń mechanicznych, w którym powierzchnię dróg oddechowych tchawicy pocierano osiowo drucianym koszem (N-Circle, ekstraktor kamieni nitinolowych bez końcówki NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s. 28.Następnie, około 10 minut po perturbacji w gabinecie bezpieczeństwa biologicznego, wykonano podanie dotchawicze LV-MP.
Pole magnetyczne użyte w tym eksperymencie zostało skonfigurowane podobnie do badania rentgenowskiego in vivo, z tymi samymi magnesami trzymanymi nad tchawicą za pomocą zacisków stentu destylacyjnego (ryc. 4).Objętość 50 µl (2 x 25 µl porcje) LV-MP podano do tchawicy (n = 3 zwierzęta) za pomocą pipety z końcówką żelową, jak opisano wcześniej.Grupa kontrolna (n = 3 zwierzęta) otrzymała ten sam LV-MP bez użycia magnesu.Po zakończeniu wlewu kaniulę usuwa się z rurki dotchawiczej i zwierzę ekstubuje.Magnes pozostaje na miejscu przez 10 minut przed usunięciem.Szczurom podawano podskórnie meloksykam (1 ml/kg) (Ilium, Australia), a następnie wycofano znieczulenie przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1 mg/kg chlorowodorku atipamazolu (Antisedan, Zoetis, Australia).Szczury utrzymywano w cieple i obserwowano aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.
Urządzenie dostarczające LV-MP w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Widać, że jasnoszara tuleja Luer-lock rurki dotchawiczej wystaje z ust, a wskazana na rysunku końcówka pipety żelowej jest wprowadzana przez rurkę dotchawiczą na żądaną głębokość do tchawicy.
Tydzień po procedurze podawania LV-MP zwierzęta humanitarnie uśmiercano przez inhalację 100% CO2 i oceniano ekspresję LacZ stosując nasze standardowe traktowanie X-gal.Usunięto trzy najbardziej doogonowe pierścienie chrząstki, aby upewnić się, że żadne uszkodzenia mechaniczne lub zatrzymanie płynów spowodowane umieszczeniem rurki dotchawiczej nie zostaną uwzględnione w analizie.Każdą tchawicę przecięto wzdłuż w celu uzyskania dwóch połówek do analizy i umieszczono w kubku zawierającym kauczuk silikonowy (Sylgard, Dow Inc) stosując igłę Minutien (Fine Science Tools) w celu uwidocznienia powierzchni światła.Rozmieszczenie i charakter transdukowanych komórek potwierdzono fotografią czołową przy użyciu mikroskopu Nikon (SMZ1500) z aparatem DigiLite i oprogramowaniem TCapture (Tucsen Photonics, Chiny).Obrazy uzyskano przy powiększeniu 20x (włączając maksymalne ustawienie dla całej szerokości tchawicy), z całą długością tchawicy wyświetlaną krok po kroku, zapewniając wystarczające nakładanie się każdego obrazu, aby umożliwić „zszywanie” obrazów.Obrazy z każdej tchawicy zostały następnie połączone w pojedynczy złożony obraz przy użyciu Composite Image Editor w wersji 2.0.3 (Microsoft Research) przy użyciu algorytmu ruchu planarnego. Obszar ekspresji LacZ w złożonych obrazach tchawicy od każdego zwierzęcia określono ilościowo za pomocą automatycznego skryptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak opisano wcześniej28, stosując ustawienia 0,35 <Barwa <0,58, Nasycenie> 0,15 i Wartość <0,7. Obszar ekspresji LacZ w złożonych obrazach tchawicy od każdego zwierzęcia określono ilościowo za pomocą automatycznego skryptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak opisano wcześniej28, stosując ustawienia 0,35 <barwa <0,58, nasycenie > 0,15 i wartość <0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 7. Obszar ekspresji LacZ w złożonych obrazach tchawicy od każdego zwierzęcia określono ilościowo za pomocą automatycznego skryptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak opisano wcześniej28 przy ustawieniach 0,350,15 i wartość <0,7.如 前所 述 ， 使用 MATLAB 脚本 （R2020A, MATHWORKS） 对 来自 每 只 动物 的 气管 复合 图像 中 的 LACZ 表达 区域 进行, 使用 0,35 <色调 <0,58 、 饱和度> 0,15 和值 <0,7 的 设置。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。如 前所 述 ， 自动 MATLAB 脚本 （（R2020A, MATHWORKS） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 <0,7 的 。。。。。 .................... CZEŚĆ P Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Obszary ekspresji LacZ na złożonych obrazach tchawicy każdego zwierzęcia określono ilościowo przy użyciu automatycznego skryptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak opisano wcześniej, stosując ustawienia 0,35 <odcień <0,58, nasycenie > 0,15 i wartość <0,7.Śledząc kontury tkanek w GIMP v2.10.24, ręcznie utworzono maskę dla każdego złożonego obrazu, aby zidentyfikować obszar tkanki i zapobiec fałszywym wykryciom poza tkanką tchawicy.Zabarwione obszary ze wszystkich złożonych obrazów od każdego zwierzęcia zsumowano, aby uzyskać całkowity wybarwiony obszar dla tego zwierzęcia.Pomalowany obszar następnie podzielono przez całkowity obszar maski, aby uzyskać obszar znormalizowany.
Każdą tchawicę zatopiono w parafinie i pocięto na skrawki o grubości 5 µm.Skrawki barwiono kontrastowo neutralną szybką czerwienią przez 5 minut, a obrazy uzyskano przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse E400, kamery DS-Fi3 i oprogramowania do przechwytywania elementów NIS (wersja 5.20.00).
Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono w GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Istotność statystyczną ustalono na p ≤ 0,05.Normalność testowano za pomocą testu Shapiro-Wilka, a różnice w barwieniu LacZ oceniano za pomocą testu t dla nieparzystych.
Sześć MP opisanych w Tabeli 1 zostało zbadanych przez PCXI, a widoczność opisano w Tabeli 2. Dwa polistyrenowe MP (MP1 i MP2; odpowiednio 18 µm i 0,25 µm) nie były widoczne przez PCXI, ale pozostałe próbki można było zidentyfikować (przykłady przedstawiono na rysunku 5).MP3 i MP4 są słabo widoczne (10-15% Fe3O4; odpowiednio 0,25 µm i 0,9 µm).Chociaż MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) zawierał jedne z najmniejszych badanych cząstek, był najbardziej wyraźny.Produkt CombiMag MP6 jest trudny do odróżnienia.We wszystkich przypadkach nasza zdolność wykrywania MF została znacznie poprawiona dzięki przesuwaniu magnesu tam iz powrotem równolegle do kapilary.Gdy magnesy oddalały się od kapilary, cząstki były wyciągane w długich łańcuchach, ale gdy magnesy zbliżały się i zwiększało się natężenie pola magnetycznego, łańcuchy cząstek skracały się, gdy cząstki migrowały w kierunku górnej powierzchni kapilary (patrz Wideo uzupełniające S1 : MP4), zwiększając gęstość cząstek na powierzchni.I odwrotnie, gdy magnes zostanie usunięty z kapilary, natężenie pola maleje, a MP przestawiają się w długie łańcuchy rozciągające się od górnej powierzchni kapilary (patrz wideo uzupełniające S2: MP4).Gdy magnes przestanie się poruszać, cząstki poruszają się jeszcze przez jakiś czas po osiągnięciu położenia równowagi.Gdy MP porusza się w kierunku i od górnej powierzchni kapilary, cząstki magnetyczne mają tendencję do wciągania zanieczyszczeń przez ciecz.
Widoczność MP pod PCXI różni się znacznie między próbkami.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6.Wszystkie pokazane tutaj obrazy zostały zrobione z magnesem umieszczonym około 10 mm bezpośrednio nad kapilarą.Widoczne duże okręgi to pęcherzyki powietrza uwięzione w kapilarach, wyraźnie pokazujące czarno-białe krawędzie obrazu z kontrastem fazowym.Czerwone pole wskazuje powiększenie zwiększające kontrast.Należy zauważyć, że średnice obwodów magnesów na wszystkich rysunkach nie są podane w skali i są około 100 razy większe niż pokazano.
Gdy magnes porusza się w lewo iw prawo wzdłuż górnej części kapilary, kąt struny MP zmienia się, aby wyrównać się z magnesem (patrz ryc. 6), wyznaczając w ten sposób linie pola magnetycznego.W przypadku MP3-5, po osiągnięciu przez cięciwę kąta progowego, cząsteczki ciągną się wzdłuż górnej powierzchni kapilary.Często powoduje to, że posłowie gromadzą się w większe grupy w pobliżu miejsca, w którym pole magnetyczne jest najsilniejsze (patrz wideo uzupełniające S3: MP5).Jest to również szczególnie widoczne podczas obrazowania blisko końca kapilary, co powoduje agregację i koncentrację MP na granicy faz ciecz-powietrze.Cząstki w MP6, które były trudniejsze do rozróżnienia niż te w MP3-5, nie ciągnęły się, gdy magnes poruszał się wzdłuż kapilary, ale struny MP rozdzieliły się, pozostawiając cząstki w widoku (patrz wideo uzupełniające S4: MP6).W niektórych przypadkach, gdy przyłożone pole magnetyczne zostało zmniejszone przez przesunięcie magnesu na dużą odległość od miejsca obrazowania, wszelkie pozostałe MPs powoli opadały grawitacyjnie na dolną powierzchnię tuby, pozostając w sznurku (patrz wideo uzupełniające S5: MP3) .
Kąt struny MP zmienia się, gdy magnes przesuwa się w prawo nad kapilarą.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6.Czerwone pole wskazuje powiększenie zwiększające kontrast.Należy pamiętać, że dodatkowe filmy służą celom informacyjnym, ponieważ ujawniają ważną strukturę cząstek i informacje dynamiczne, których nie można zwizualizować na tych statycznych obrazach.
Nasze testy wykazały, że powolne przesuwanie magnesu w przód iw tył wzdłuż tchawicy ułatwia wizualizację MF w kontekście złożonego ruchu in vivo.Nie przeprowadzono testów in vivo, ponieważ kulki polistyrenu (MP1 i MP2) nie były widoczne w kapilarze.Każdy z pozostałych czterech MF był testowany in vivo z długą osią magnesu umieszczoną nad tchawicą pod kątem około 30 ° do pionu (patrz ryciny 2b i 3a), ponieważ skutkowało to dłuższymi łańcuchami MF i było bardziej skuteczne niż magnes..konfiguracja zakończona.MP3, MP4 i MP6 nie zostały znalezione w tchawicy żadnych żywych zwierząt.Podczas wizualizacji układu oddechowego szczurów po humanitarnym uśmierceniu zwierząt cząsteczki pozostawały niewidoczne nawet po dodaniu dodatkowej objętości za pomocą pompy strzykawkowej.MP5 miał najwyższą zawartość tlenku żelaza i był jedyną widoczną cząstką, więc został użyty do oceny i scharakteryzowania zachowania MP in vivo.
Umieszczenie magnesu nad tchawicą podczas wprowadzania MF spowodowało, że wiele, ale nie wszystkie, MF były skoncentrowane w polu widzenia.Wnikanie cząstek do tchawicy najlepiej obserwuje się u zwierząt uśmierconych w sposób humanitarny.Rycina 7 i dodatkowe wideo S6: MP5 pokazuje szybkie wychwytywanie magnetyczne i wyrównanie cząstek na powierzchni tchawicy brzusznej, co wskazuje, że MP można skierować do pożądanych obszarów tchawicy.Podczas przeszukiwania bardziej dystalnie wzdłuż tchawicy po porodzie MF, niektóre MF znaleziono bliżej ostrogi, co wskazuje na niewystarczające natężenie pola magnetycznego do zebrania i utrzymania wszystkich MF, ponieważ zostały one dostarczone przez obszar maksymalnego natężenia pola magnetycznego podczas podawania płynów.proces.Jednak pourodzeniowe stężenia MP były wyższe wokół obszaru obrazu, co sugeruje, że wiele MP pozostało w obszarach dróg oddechowych, w których przyłożona siła pola magnetycznego była najwyższa.
Obrazy (a) przed i (b) po dostarczeniu MP5 do tchawicy niedawno uśpionego szczura z magnesem umieszczonym tuż nad obszarem obrazowania.Przedstawiony obszar znajduje się pomiędzy dwoma pierścieniami chrzęstnymi.Przed dostarczeniem MP w drogach oddechowych znajduje się trochę płynu.Czerwone pole wskazuje powiększenie zwiększające kontrast.Te obrazy pochodzą z filmu zamieszczonego w S6: Dodatkowe wideo MP5.
Przesuwanie magnesu wzdłuż tchawicy in vivo spowodowało zmianę kąta łańcucha MP na powierzchni dróg oddechowych, podobną do obserwowanej w naczyniach włosowatych (patrz ryc. 8 i wideo uzupełniające S7: MP5).Jednak w naszym badaniu posłów nie można było przeciągać po powierzchni żywych dróg oddechowych, tak jak mogłyby to robić naczynia włosowate.W niektórych przypadkach łańcuch MP wydłuża się, gdy magnes porusza się w lewo iw prawo.Co ciekawe, odkryliśmy również, że łańcuch cząstek zmienia głębokość warstwy powierzchniowej płynu, gdy magnes jest przesuwany wzdłużnie wzdłuż tchawicy, i rozszerza się, gdy magnes jest przesuwany bezpośrednio nad głową, a łańcuch cząstek jest obracany do pozycji pionowej (zob. Wideo uzupełniające S7).: MP5 o 0:09, prawy dolny róg).Charakterystyczny wzorzec ruchu zmieniał się, gdy magnes przesuwano poprzecznie w poprzek górnej części tchawicy (tj. na lewo lub na prawo od zwierzęcia, a nie wzdłuż tchawicy).Cząstki były nadal wyraźnie widoczne podczas ich ruchu, ale kiedy magnes został usunięty z tchawicy, końcówki strun cząstek stały się widoczne (patrz wideo uzupełniające S8: MP5, począwszy od 0:08).Jest to zgodne z obserwowanym zachowaniem pola magnetycznego pod działaniem przyłożonego pola magnetycznego w szklanej kapilarze.
Przykładowe obrazy przedstawiające MP5 w tchawicy żywego, znieczulonego szczura.(a) Magnes służy do akwizycji obrazów powyżej i na lewo od tchawicy, a następnie (b) po przesunięciu magnesu w prawo.Czerwone pole wskazuje powiększenie zwiększające kontrast.Te obrazy pochodzą z filmu zamieszczonego w dodatkowym filmie S7: MP5.
Kiedy dwa bieguny zostały dostrojone w orientacji północ-południe powyżej i poniżej tchawicy (tj. przyciąganie; ryc. 3b), akordy MP wydawały się dłuższe i znajdowały się raczej na bocznej ścianie tchawicy niż na grzbietowej powierzchni tchawicy. tchawica (patrz Załącznik).Wideo S9:MP5).Jednak po podaniu płynu za pomocą urządzenia z dwoma magnesami, co zwykle występuje w przypadku urządzenia z jednym magnesem, nie wykryto wysokich stężeń cząstek w jednym miejscu (tj. na powierzchni grzbietowej tchawicy).Następnie, gdy jeden magnes został skonfigurowany do odpychania przeciwnych biegunów (ryc. 3c), liczba cząstek widocznych w polu widzenia nie wzrosła po dostarczeniu.Ustawienie obu konfiguracji magnesów jest trudne ze względu na duże natężenie pola magnetycznego, które odpowiednio przyciąga lub popycha magnesy.Konfiguracja została następnie zmieniona na pojedynczy magnes równoległy do ​​dróg oddechowych, ale przechodzący przez drogi oddechowe pod kątem 90 stopni, tak że linie siły przecinały ścianę tchawicy prostopadle (ryc. ściana boczna.być obserwowanym.Jednak w tej konfiguracji nie było możliwego do zidentyfikowania ruchu akumulacji MF lub ruchu magnesu.Na podstawie wszystkich tych wyników wybrano konfigurację z pojedynczym magnesem i orientacją 30 stopni do badań in vivo nosicieli genów (ryc. 3a).
Kiedy zwierzę było obrazowane wiele razy bezpośrednio po humanitarnym uśmierceniu, brak zakłócającego ruchu tkanki oznaczał, że w czystym polu międzychrzęstnym można było dostrzec drobniejsze, krótsze linie cząstek, „kołysząc się” zgodnie z ruchem translacyjnym magnesu.wyraźnie zobaczyć obecność i ruch cząstek MP6.
Miano LV-LacZ wynosiło 1,8 x 108 IU/ml, a po zmieszaniu 1:1 z CombiMag MP (MP6) zwierzętom wstrzyknięto 50 µl dawki dotchawiczej 9 x 107 IU/ml nośnika LV (tj. 4,5 x 106 TU/szczura).).).W tych badaniach, zamiast przesuwać magnes podczas porodu, unieruchomiliśmy magnes w jednej pozycji, aby określić, czy transdukcja LV mogłaby (a) ulec poprawie w porównaniu z dostarczaniem wektora przy braku pola magnetycznego oraz (b) czy drogi oddechowe mogłyby być skupionym.Komórki są transdukowane w magnetycznych obszarach docelowych górnych dróg oddechowych.
Obecność magnesów i użycie CombiMag w połączeniu z wektorami LV nie wydaje się mieć negatywnego wpływu na zdrowie zwierząt, podobnie jak nasz standardowy protokół dostarczania wektorów LV.Obrazy czołowe obszaru tchawicy poddanego perturbacji mechanicznej (rysunek uzupełniający 1) wykazały, że grupa leczona LV-MP miała znacznie wyższy poziom transdukcji w obecności magnesu (ryc. 9a).Tylko niewielka ilość niebieskiego barwienia LacZ była obecna w grupie kontrolnej (Figura 9b).Kwantyfikacja znormalizowanych regionów wybarwionych X-Gal wykazała, że ​​podawanie LV-MP w obecności pola magnetycznego skutkowało około 6-krotną poprawą (ryc. 9c).
Przykład złożonych obrazów przedstawiających transdukcję tchawicy za pomocą LV-MP (a) w obecności pola magnetycznego i (b) przy braku magnesu.(c) Istotna statystycznie poprawa znormalizowanego obszaru transdukcji LacZ w tchawicy przy użyciu magnesu (*p = 0,029, test t, n = 3 na grupę, średnia ± błąd standardowy średniej).
Skrawki barwione na czerwono o neutralnym szybkim zabarwieniu (przykład pokazany na ryc. Uzupełniającej 2) wskazywały, że komórki barwione LacZ były obecne w tej samej próbce iw tym samym miejscu, jak podano wcześniej.
Kluczowym wyzwaniem w terapii genowej dróg oddechowych pozostaje precyzyjna lokalizacja cząstek nośnika w interesujących nas obszarach oraz osiągnięcie wysokiego poziomu wydajności transdukcji w ruchomym płucu przy przepływie powietrza i aktywnym usuwaniu śluzu.W przypadku nośników LV przeznaczonych do leczenia chorób układu oddechowego w mukowiscydozie zwiększenie czasu przebywania cząstek nośnika w przewodzących drogach oddechowych było dotychczas nieosiągalnym celem.Jak zauważyli Castellani i wsp., wykorzystanie pól magnetycznych do wzmocnienia transdukcji ma przewagę nad innymi metodami dostarczania genów, takimi jak elektroporacja, ponieważ może łączyć prostotę, oszczędność, miejscowe dostarczanie, zwiększoną wydajność i krótszy czas inkubacji.i ewentualnie niższą dawkę nośnika10.Jednak nigdy nie opisano osadzania się in vivo i zachowania cząstek magnetycznych w drogach oddechowych pod wpływem zewnętrznych sił magnetycznych, aw rzeczywistości nie wykazano in vivo zdolności tej metody do zwiększania poziomu ekspresji genów w nienaruszonych, żywych drogach oddechowych.
Nasze eksperymenty in vitro na synchrotronie PCXI wykazały, że wszystkie badane przez nas cząstki, z wyjątkiem polistyrenu MP, były widoczne w zastosowanym przez nas układzie obrazowania.W obecności pola magnetycznego pola magnetyczne tworzą struny, których długość jest związana z rodzajem cząstek i siłą pola magnetycznego (tj. bliskością i ruchem magnesu).Jak pokazano na rycinie 10, obserwowane przez nas struny powstają, gdy każda pojedyncza cząsteczka zostaje namagnesowana i indukuje własne lokalne pole magnetyczne.Te oddzielne pola powodują, że inne podobne cząstki gromadzą się i łączą z grupowymi ruchami strun z powodu lokalnych sił pochodzących z lokalnych sił przyciągania i odpychania innych cząstek.
Schemat przedstawiający (a, b) łańcuchy cząstek tworzących się wewnątrz wypełnionych płynem naczyń włosowatych oraz (c, d) tchawicę wypełnioną powietrzem.Należy zauważyć, że naczynia włosowate i tchawica nie są narysowane w skali.Panel (a) zawiera również opis cząstek MF zawierających Fe3O4 ułożonych w łańcuchy.
Kiedy magnes przesuwał się nad kapilarą, kąt ciągu cząstek osiągnął próg krytyczny dla MP3-5 zawierającego Fe3O4, po czym ciąg cząstek nie pozostawał już w swoim pierwotnym położeniu, ale przemieszczał się wzdłuż powierzchni do nowego położenia.magnes.Efekt ten prawdopodobnie występuje, ponieważ powierzchnia szklanej kapilary jest wystarczająco gładka, aby umożliwić wystąpienie tego ruchu.Co ciekawe, MP6 (CombiMag) nie zachowywał się w ten sposób, być może dlatego, że cząsteczki były mniejsze, miały inną powłokę lub ładunek powierzchniowy lub opatentowany płyn nośny wpłynął na ich zdolność do poruszania się.Kontrast na obrazie cząstek CombiMag jest również słabszy, co sugeruje, że ciecz i cząstki mogą mieć tę samą gęstość i dlatego nie mogą się łatwo zbliżać do siebie.Cząstki mogą również utknąć, jeśli magnes porusza się zbyt szybko, co wskazuje, że natężenie pola magnetycznego nie zawsze może pokonać tarcie między cząstkami w płynie, co sugeruje, że natężenie pola magnetycznego i odległość między magnesem a obszarem docelowym nie powinny być niespodzianka.ważny.Wyniki te wskazują również, że chociaż magnesy mogą wychwytywać wiele mikrocząstek przepływających przez obszar docelowy, jest mało prawdopodobne, aby magnesy przesuwały cząstki CombiMag wzdłuż powierzchni tchawicy.W związku z tym doszliśmy do wniosku, że badania in vivo LV MF powinny wykorzystywać statyczne pola magnetyczne do fizycznego celowania w określone obszary drzewa dróg oddechowych.
Po dostarczeniu cząstek do organizmu trudno je zidentyfikować w kontekście złożonej ruchomej tkanki ciała, ale ich zdolność wykrywania została ulepszona poprzez przesuwanie magnesu poziomo nad tchawicą, aby „poruszać” strunami MP.Chociaż możliwe jest obrazowanie w czasie rzeczywistym, łatwiej jest dostrzec ruch cząstek po humanitarnym zabiciu zwierzęcia.Stężenia MP były zwykle najwyższe w tym miejscu, gdy magnes znajdował się nad obszarem obrazowania, chociaż niektóre cząsteczki znajdowały się zwykle w głębi tchawicy.W przeciwieństwie do badań in vitro, cząstki nie mogą zostać przeciągnięte w dół tchawicy przez ruch magnesu.Odkrycie to jest zgodne z tym, w jaki sposób śluz pokrywający powierzchnię tchawicy zazwyczaj przetwarza wdychane cząsteczki, zatrzymując je w śluzie, a następnie usuwając je poprzez mechanizm oczyszczania śluzowo-rzęskowego.
Postawiliśmy hipotezę, że użycie magnesów powyżej i poniżej tchawicy do przyciągania (ryc. 3b) może skutkować bardziej jednorodnym polem magnetycznym, a nie polem magnetycznym, które jest silnie skoncentrowane w jednym punkcie, co potencjalnie skutkuje bardziej równomiernym rozkładem cząstek..Jednak nasze wstępne badanie nie znalazło wyraźnych dowodów na poparcie tej hipotezy.Podobnie ustawienie pary magnesów do odpychania (ryc. 3c) nie spowodowało osiadania większej liczby cząstek w obszarze obrazu.Te dwa odkrycia pokazują, że konfiguracja z dwoma magnesami nie poprawia znacząco lokalnej kontroli wskazywania MP i że wynikające z tego silne siły magnetyczne są trudne do dostrojenia, co czyni to podejście mniej praktycznym.Podobnie, zorientowanie magnesu powyżej i w poprzek tchawicy (ryc. 3d) również nie zwiększyło liczby cząstek pozostających w obrazowanym obszarze.Niektóre z tych alternatywnych konfiguracji mogą się nie powieść, ponieważ powodują zmniejszenie natężenia pola magnetycznego w strefie osadzania.Zatem konfiguracja pojedynczego magnesu pod kątem 30 stopni (ryc. 3a) jest uważana za najprostszą i najbardziej wydajną metodę testowania in vivo.
Badanie LV-MP wykazało, że gdy wektory LV połączono z CombiMag i dostarczono po fizycznym zakłóceniu w obecności pola magnetycznego, poziomy transdukcji w tchawicy znacznie wzrosły w porównaniu z grupą kontrolną.Na podstawie badań obrazowania synchrotronowego i wyników LacZ wydaje się, że pole magnetyczne jest w stanie utrzymać LV w tchawicy i zmniejszyć liczbę cząstek wektorów, które natychmiast wnikają głęboko do płuc.Takie ulepszenia ukierunkowania mogą prowadzić do wyższej wydajności przy jednoczesnym zmniejszeniu dostarczanych mian, nieukierunkowanej transdukcji, zapalnych i immunologicznych skutków ubocznych oraz kosztów transferu genów.Co ważne, zdaniem producenta, CombiMag można stosować w połączeniu z innymi metodami transferu genów, w tym innymi wektorami wirusowymi (takimi jak AAV) i kwasami nukleinowymi.